美观、平衡、稳定一直是口腔正畸矫治的三大目标，诸多学者致力于正畸的美观与平衡，而稳定目标多在正畸后的保持期中实现，并常被忽略。正畸患者多为青少年，保持期的稳定与患者依从性、剩余发育量、正畸牙周围骨改建进程等因素有关，其中骨改建对保持阶段至关重要。如何在正畸治疗结束后促进骨改建进程、缩短保持期、降低错畸形复发率是国内外学者广泛关注的课题。

近年来，学者们开展了很多关于物理与化学药物干预牙周组织改建的研究，但化学药物疗法会引起广泛和不良的全身反应，因而具有良好穿透性与生物安全性的物理激光疗法一直备受关注，并已广泛应用于口腔医学各个领域。研究表明，低能量激光（low-level laser，LLL）能够加速牙齿移动^[1-2]，加速牙周纤维的改建并增加胶原纤维的沉积^[3]，促进成骨细胞的增殖分化和压力侧破骨细胞的形成^[4-5]。在前期研究中，我们发现LLL可显著缩短大鼠牙齿移动模型保持期的时间，促进稳定^[6]，但具体的骨改建机制仍不清楚。本研究拟通过建立大鼠牙齿移动后保持模型并进行LLL干预，检测不同时间点骨改建因子的变化，探究LLL对大鼠牙齿移动后保持期骨改建因子的影响，进一步为临床研究提供依据。

选取80只8周龄雄性健康Wistar大鼠，体重280~300 g，SPF级[北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010]。

镍钛拉簧（深圳速航科技发展有限公司）；正畸用弹簧测力计（杭州新亚齿科材料有限公司）；二极管激光器（中国医学科学院物理放射研究所）；RaPure微量组织细胞RNA提取试剂盒（美国Magen公司）；TaKaRa RR037A反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；TB Green Real Time PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）；Eppendorf 5417c离心机（德国Eppendorf公司）；LightCycler480实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

参照King等^[7]的方法建立大鼠第一磨牙近中移动模型，步骤如下：用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定，用直径0.2 mm的结扎丝将镍钛拉簧固定于右侧上颌第一磨牙牙颈部，另一端用直径0.25 mm的结扎丝结扎于右侧上颌切牙，用测力计测量使第一磨牙近中移动的拉力为0.49 N，最后用化学固化树脂在右侧上颌切牙上进行固定。主动加力时间为21 d，每7 d进行一次主动加力，加力后每天检查加力装置是否脱落，如有脱落重新安装。

将80只Wistar大鼠随机分为空白对照组和4个第一磨牙近中移动模型组（复发组、保持组、保持+激光组、复发+激光组），每组16只。（1）空白对照组：不进行主动加力，不施加任何措施。（2）复发组：21 d主动加力结束后拆除口内装置，不施加保持措施。（3）保持组：21 d主动加力结束后拆除口内装置，用直径0.25 mm的结扎丝于大鼠切牙与第一磨牙间拧成麻花状，固定第一磨牙的位置作为保持装置。定期检查是否脱落，发现装置脱落及时安装。（4）保持+激光组：21 d主动加力结束后拆除口内装置，用直径0.25 mm的结扎丝于大鼠切牙与第一磨牙间拧成麻花状，固定第一磨牙的位置作为保持装置，并在去除加力装置后的隔日照射LLL。（5）复发+激光组：21 d主动加力结束后拆除口内装置，不施加保持措施，并在去除加力装置后的隔日照射LLL。

应用中国医学科学院生物工程研究所提供的波长808 nm、功率100 mW的二极管激光器进行隔日照射。照射位置为右侧上颌第一磨牙颊侧与腭侧龈缘下平行于牙根中部的2个位点，照射时间为每个位点7 s，照射光斑直径为2 mm，能量密度为23 J/cm²。

从美国国立生物技术信息中心数据库查询大鼠的基因序列，由日本TaKaRa公司合成设计引物序列（表 1）。

表 1 (Tab 1)

表 1 引物序列 基因名称 上游引物(5'-3') 下游引物(5'-3') β-actin GGCGGCACCACCATGTACCCT AGGGGCCGGACTCGTCATACT Runx2 TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG ATGGCCGGGAATGATGAG ALP AAATGCCCTGAAACTCCAAA ATCTCCAGCCGTGTCTCCTC COLⅠ AGAATATGTATCACCAGACGCAGAA GACCACGAGGACCAGAAGGA NFATc CATGCAGGAATTGCCGAGAC CTCCAATGTGCTGAATAGGAGTG CTSK TTTGCCGTGGCGTTATACATACA CGGCTATATGACCACTGCCTTC MMP9 TGGAAACTCACACGCCAGAAG AGCCGGGAACGTATCTGGA β-actin：β-肌动蛋白；Runx2：Runt相关转录因子2；ALP：碱性磷酸酶；COLⅠ：Ⅰ型胶原蛋白；NFATc：活化T细胞核因子；CTSK：组织蛋白酶K；MMP9：基质金属蛋白酶9.

表 1 引物序列

主动加力21 d后大鼠进入保持期，在第2、5、10、15天处死大鼠，切取第一磨牙周围2 mm的牙周组织块。将组织放入研钵中，倒入液氮，研磨至均一状，待液氮挥发后转移至1.5 mL EP管中。按RaPure微量组织细胞RNA提取试剂盒的操作步骤进行总RNA提取。用分光光度计测定260 nm和280 nm下的光密度值，判断总体RNA的浓度和纯度。选取浓度和纯度良好的RNA，最终选取的RNA浓度范围为683.55~931.37 ng/μL，纯度范围为1.93~2.11，并显示无盐与有机溶剂的残留。

用TaKaRaRR037A反转录试剂盒将高质量的RNA在70 μL反应体系的PCR仪上进行cDNA合成。用2 μL反应产物作为模板在LightCycler 480实时荧光定量PCR仪中进行两步法PCR。PCR反应条件：预变性95℃ 30 s；变性95℃ 5 s、退火和延伸60 ℃1 min，循环40次。以β-actin为内参基因，采用2^－ΔΔCt法计算骨改建因子Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原蛋白（type Ⅰ collagen，COLⅠ）、活化T细胞核因子（nuclear factor-activated T cell，NFATc）、组织蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的相对表达量。

应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析。本实验为随机样本，骨改建因子的相对表达量数据符合正态分布，以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。

qPCR检测结果如图 1所示。在保持期的4个检测时间点，4个模型组的骨改建因子Runx2、ALP的mRNA表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图 1 大鼠正畸保持期不同干预措施下不同时间点骨改建因子的表达 A：Runx2 mRNA表达；B：ALP mRNA表达；C：COLⅠ mRNA表达；D：NFATc mRNA表达；E：CTSK mRNA表达；F：MMP9 mRNA表达. *P＜0.05，**P＜0.01与空白对照组比较；△P＜0.05，△△P＜0.01与保持组比较；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01与复发组比较. n＝4，x±s. Runx2：Runt相关转录因子2；ALP：碱性磷酸酶；COLⅠ：Ⅰ型胶原蛋白；NFATc：活化T细胞核因子；CTSK：组织蛋白酶K；MMP9：基质金属蛋白酶9.

保持组骨改建因子COLⅠ mRNA除保持期第10天的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余时间点COLⅠ mRNA的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；其他模型组COLⅠ mRNA在保持期4个检测时间点的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。保持组骨改建因子NFATc mRNA除保持期第2、10天的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）外，其余时间点NFATc mRNA的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）；其他模型组NFATc mRNA在保持期4个检测时间点的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。保持组骨改建因子CTSK mRNA除保持期第2、5天的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）外，其余时间点CTSK mRNA的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；其他模型组CTSK mRNA在保持期4个检测时间点的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。保持组和保持+激光组骨改建因子MMP9 mRNA除保持期第2天的表达与空白对照组比较差异无统计学意义（P均＞0.05）外，其余时间点这两组MMP9 mRNA的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；复发组和复发+激光组在保持期4个检测时间点MMP9 mRNA的表达均较空白对照组升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

复发组骨改建因子Runx2、ALP、COLⅠ、NFATc、CTSK、MMP9的mRNA表达较保持组均呈增加趋势（P均＜0.01）。随着时间延长，保持+激光组骨改建因子的Runx2、ALP、COLⅠ、NFATc、CTSK、MMP9 mRNA表达较保持组升高，从第5天开始差异均有统计学意义（P均＜0.05）至第10天差异最为明显。复发+激光组除MMP9外的5个骨改建因子的mRNA表达在保持期的大部分时间点均较复发组升高（P均＜0.05）。

我们前期的研究结果显示LLL照射可降低大鼠牙齿移动后的复发率，并缩短保持时间^[6]，这种宏观变化的具体分子机制值得进一步探讨。根据前期研究结果中的复发曲线，本研究选取了第2、5、10、15天作为时间节点检测大鼠牙槽骨周围骨改建因子的变化情况，探讨LLL对于保持期骨改建因子表达的影响。

正畸保持是一个牙周组织改建的生理过程，包括成骨细胞合成骨基质、破骨细胞骨吸收和牙周纤维的改建。本实验选取的成骨因子中，Runx2的表达被认为是成骨细胞活性和骨形成的早期标志物^[8]，在成骨细胞成熟和内稳态中起基础作用^[9]。ALP和COLⅠ都是成骨细胞分化的早期标志物^[10]，ALP能促进骨矿物质的形成和矿化^[11]，是骨形成的敏感指标；COLⅠ是成骨细胞外基质的基本组成部分^[12]，COLⅠ表达量的变化可以反映牙周胶原纤维的变化。

本实验选取的破骨因子中，CTSK是骨吸收过程中的一种主要蛋白酶，在成纤维细胞的胶原降解中起重要作用^[13]。MMP9也是破骨细胞产生的主要蛋白酶之一。NFATc1可调节破骨细胞分化和功能^[14]，NFATc1被移位到细胞核后促进其自身及一些特定破骨细胞基因的表达，其中由核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）诱导的相关基因即包括上述的MMP9、CTSK等。

本实验中复发+激光组与复发组比较和保持+激光组与保持组比较的结果进一步证实LLL对于保持与复发牙齿的牙槽骨改建具有双向调控性，在基因水平上都促进了骨改建因子表达量增加，即促进保持过程中牙齿的稳定与复发过程中牙齿的移动，这与既往研究结果^[15]相似。

LLL对骨改建因子的促进作用与激光照射次数有关，表现为累积效应，但累积效应不随照射次数无限增长，到达与生物体相关的结构与机能的剂量后随着照射次数的增加不再表现为促进作用。因此本实验分不同的时间节点，发现对于保持期的牙齿在相应的骨改建时间内，主动矫治加力结束后的前10 d用LLL干预最有效。

本研究结果显示，复发组骨改建因子的相对表达量明显高于保持组。这可能与牙槽骨骨改建本身的特点和复发牙齿的牙周纤维韧带的力量有关。Johnston等^[16]报道了牙齿移动后牙周组织中仍然存在显著的力。牙周纤维在牙齿移动过程中会伸展和移位，然后随着正畸力的去除与时间的推移有垂直于牙齿表面重新排列的趋势，其中骨组织也会产生对牙周韧带力的反应并重新排列。因此，复发组因牙周韧带纤维牵拉使骨改建因子表达活跃；保持组因固定保持装置降低了牙周纤维的牵拉与牙齿的复发移动倾向，表现为骨改建因子的活跃度较复发组低。

对比复发+激光组与保持+激光组，4个检测时间点的骨改建因子的相对表达量大部分表现为复发+激光组＞复发组＞保持+激光组＞保持组。但在主动矫治加力结束后的第10天，即本实验中保持+激光组骨改建因子表达的高峰期，成骨相关因子ALP与破骨相关因子CTSK的基因表达量为保持+激光组＞复发组，说明虽然固定保持装置会使骨改建活跃度下降，但在LLL干预下会使保持期牙齿的骨改建因子表达量一定程度上升，表现为骨改建因子的表达量大于同期的复发组，具体机制还需进一步研究。

此外，复发+激光组骨改建因子MMP9 mRNA的表达量在4个时间点均低于复发组。早有学者发现，MMP9是参与破骨细胞侵袭活动的主要基质金属蛋白酶^[17]，但MMP9对侵袭的作用主要是发生在对破骨细胞吸收活动本身没有影响的情况下。因此，MMP9在侵袭而不是吸收的作用中与它在破骨细胞分化过程中的早期表达可能没有明显差异。我们认为本实验中LLL对于复发的牙齿仅促进了破骨细胞功能的活跃，并对破骨细胞分化与侵袭有一定影响。

综上所述，我们在既往研究中发现LLL可以促进保持期牙齿的稳定、加速复发牙齿的移动，本实验在基因水平上说明这种作用可能源于对牙槽骨成骨与破骨改建因子的调控作用。成骨与破骨改建因子的活化可能加速了牙槽骨的改建，促进牙槽骨进入稳定期，进而缩短保持时间、促进稳定，最佳时间节点为正畸保持期的前10 d。今后，我们拟进一步采用免疫组织化学染色实验、蛋白质印迹法等验证LLL对正畸保持期间骨改建的影响，为临床研究提供依据。