1型糖尿病是由于环境、遗传、自身免疫等因素导致胰岛β细胞破坏，致使胰岛素绝对缺乏而引起的一种疾病，该类患者主要通过注射胰岛素来控制血糖^[1]。研究显示，1型糖尿病患者可发生骨代谢指标及骨密度变化，甚至存在骨几何微结构改变，因此其骨抗弯曲及扭转载荷能力下降，发生骨质疏松及骨折的概率较正常人大大增高^[2]。有研究认为1型糖尿病患者体内胰岛素缺乏，使胰岛素与促进骨形成的因子甲状旁腺激素及胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）的协同作用下降，影响成骨前体细胞和骨细胞的增殖、分化及基质合成^[3]。胰岛素缺乏还影响维生素D的代谢，导致骨量降低^[4]。此外，高血糖导致的氧化应激可直接影响成骨细胞和破骨细胞，打破骨重建平衡；高血糖环境也可能引起血管病变、减少骨骼血液供应而引起骨代谢异常^[5]。

二甲双胍是治疗2型糖尿病的常用药物，有研究发现其用于1型糖尿病患者中可以改善胰岛素的敏感性，同时减少胰岛素使用剂量，因此可与胰岛素联合使用治疗1型糖尿病^[6]。二甲双胍除具有控制血糖、抑制血糖大幅波动的作用^[7]外，对骨代谢亦有一定的作用。Kanazawa等^[8]认为二甲双胍对骨代谢的影响主要通过促进骨形成及抑制骨吸收发挥作用，其可通过激活腺苷一磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）信号途径激活骨转录因子Runx2，促进成骨细胞增殖和分化；Takeno等^[9]发现二甲双胍可降低同型半胱氨酸水平，抑制其诱导的骨细胞凋亡，发挥骨保护作用；Liu等^[10]发现二甲双胍通过上调骨保护素的表达抑制核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）信号通路，继而抑制破骨细胞分化；亦有研究认为二甲双胍可逆转高血糖及晚期糖基化终末产物对骨的直接损害作用，保护骨组织^[11-13]。目前关于二甲双胍在2型糖尿病患者骨质疏松中的作用研究较多，而其对1型糖尿病患者骨代谢及骨密度影响的报道较少。本研究观察使用不同剂量二甲双胍联合胰岛素与单纯使用胰岛素治疗对1型糖尿病患者骨代谢相关生化指标和骨密度的影响，探讨二甲双胍对1型糖尿病患者骨代谢的作用。

本研究为回顾性研究，选取2014年1月至2019年5月兰州大学第一医院收治的1型糖尿病患者作为研究对象。纳入标准：（1）符合WHO制定的1型糖尿病诊断标准^[14]；（2）年龄≥ 18岁；（3）意识清醒，能正常活动，理解能力正常；（4）近3个月未使用过二甲双胍或其他口服降糖药；（5）临床资料完整。排除标准：（1）诊断为2型糖尿病或其他特殊类型糖尿病；（2）患有严重肝、肾功能不全；（3）患有影响骨代谢的疾病（如多发性骨髓瘤、甲状腺疾病、甲状旁腺疾病、自身免疫性疾病等）或近期骨折；（4）近6个月有影响骨代谢指标的特殊用药史（如糖皮质激素、抗肿瘤药物、环孢素A、钙剂、双膦酸盐等）。共128例患者符合纳入和排除标准，其中67例采用胰岛素联合二甲双胍治疗，设为观察组；61例采用单纯胰岛素治疗，设为对照组。为了分析不同剂量二甲双胍对患者骨代谢相关指标的影响，观察组患者依据使用二甲双胍的剂量分为低剂量（0.5 g/d）组（20例）、中剂量（1.0 g/d）组（23例）和高剂量（1.5 g/d）组（24例）。本研究经兰州大学第一医院伦理委员会审批，通过电话随访方式告知所有患者及其家属使用其临床检查及治疗数据用于非利益学术出版，获得知情同意。

通过回顾性查阅住院及门诊资料获得患者治疗方法。对照组患者均采用单纯胰岛素皮下注射降糖治疗，起始剂量为0.5~1.0 IU/kg，根据血糖变化调整胰岛素用量。观察组患者除按对照组方案使用胰岛素外还加用二甲双胍治疗，二甲双胍剂量为0.5~1.5 g/d，二甲双胍使用时间至少72周，使用过程中连续停用时间不超过1周，合计停用时间不超过1个月。

收集两组患者的人口学资料，以及治疗前及连续治疗72周后的空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、25-羟维生素D[25-hydroxyvitamin D，25（OH）D]、骨特异性碱性磷酸酶（bone specific alkaline phosphatase，BALP）、氨基端中分子片段骨钙蛋白（N-terminal mid-fragment of osteocalcin，N-MID OC）、血清钙、血清磷、尿钙/肌酐比值及腰椎骨密度等资料。25（OH）D、BALP、N-MID OC、血清钙、血清磷及尿钙/肌酐比值使用美国Beckman Coulter公司AU5800临床化学分析仪测定，腰椎骨密度使用美国GE公司Lunar iDXA双能X线骨密度仪测定。

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析并采用最小显著性差异法进行多重比较，组内治疗前后比较采用配对t检验。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。采用多元线性回归分析评估年龄、BMI、糖化血红蛋白、二甲双胍等对骨代谢相关指标的影响。检验水准（α）为0.05。

由表 1可见，观察组与对照组患者年龄、性别、病程、身高、体重、BMI、肾小球滤过率、游离三碘甲腺原氨酸、游离甲状腺素、促甲状腺激素等基线资料相似，具有可比性。由表 2可见，观察组与对照组患者治疗前血糖、骨代谢生化指标及腰椎骨密度差异均无统计学意义（P均>0.05）；两组患者治疗72周后空腹血糖、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白均较治疗前下降（P均 < 0.05），但两组之间相比差异无统计学意义（P均>0.05）；观察组患者治疗72周后BALP、N-MID OC、腰椎骨密度均较治疗前升高且高于对照组治疗后（P均 < 0.05），25（OH）D、血清钙、血清磷、尿钙/肌酐比值与治疗前及对照组治疗后相比差异均无统计学意义（P均>0.05）；对照组患者腰椎骨密度及骨代谢相关指标与治疗前比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。观察组患者中，有12例已诊断为骨质疏松症，治疗后腰椎骨密度Z值与治疗前相比差异无统计学意义（－2.32±0.27 vs －2.48±0.21，P=0.31）。

表 1 (Tab 1)

表 1 两组1型糖尿病患者的基线资料比较 Tab 1 Comparison of baseline data of patients with type 1 diabetes mellitus between 2 groups Index Observation group N=67 Control group N=61 Age/year, x±s 48.90±13.76 48.87±13.46 Male, n (%) 35 (52.2) 26 (42.6) Course of disease/year, x±s 6.30±3.10 7.20±2.80 Body height/cm, x±s 165.54±7.94 166.52±7.78 Body weight/kg, x±s 57.61±10.06 58.48±8.83 BMI/(kg·m－2), x±s 20.83±1.80 20.97±1.87 GFR/(mL·min－1), x±s 121.18±30.99 116.09±30.27 FT3/(pmol·L－1), x±s 3.24±1.29 3.40±1.20 FT4/(pmol·L－1), x±s 27.93±10.68 28.06±10.55 TSH/(mIU·L－1), x±s 3.50±1.76 3.88±1.81 Observation group: The patients received insulin combined with metformin therapy; Control group: The patients received insulin alone therapy. BMI: Body mass index; GFR: Glomerular filtration rate; FT3: Free triiodothyronine; FT4: Free thyroxine; TSH: Thyroid-stimulating hormone.

表 1 两组1型糖尿病患者的基线资料比较 Tab 1 Comparison of baseline data of patients with type 1 diabetes mellitus between 2 groups

表 2 (Tab 2)

表 2 观察组与对照组1型糖尿病患者治疗前后血糖及骨代谢相关指标比较 Tab 2 Comparison of blood glucose and bone metabolism-related parameters of patients with type 1 diabetes mellitus between observation group and control group   x±s Index Before treatment After treatment for 72 weeks Observation group n=67 Control group n=61 Observation group n=67 Control group n=61 FPG/(mmol·L－1) 11.98±3.08 10.95±3.03 8.92±2.33* 9.56±2.38* 2hPG/(mmol·L－1) 16.54±4.99 15.03±4.12 10.97±2.35* 11.40±2.28* HbA1c/% 11.26±3.29 10.68±3.15 8.58±2.37* 9.05±2.26* 25(OH)D/(nmol·L－1) 42.69±16.41 38.68±17.12 44.32±16.95 40.80±17.47 BALP/(μg·L－1) 23.46±7.55 23.20±7.80 27.42±8.43* 21.99±7.43△△ N-MID OC/(ng·mL－1) 14.62±6.11 15.69±6.87 19.50±7.25* 15.32±6.57△△ Serum calcium/(mmol·L－1) 2.40±0.38 2.29±0.41 2.38±0.36 2.30±0.40 Serum phosphorus/(mmol·L－1) 1.44±0.34 1.55±0.32 1.42±0.31 1.49±0.33 Urinary Ca/Cra 0.14±0.07 0.14±0.07 0.12±0.06 0.14±0.07 Lumbar vertebra BMD Z value －1.54±0.78 －1.45±0.90 －1.23±0.89* －1.59±0.82△ Observation group: The patients received insulin combined with metformin therapy; Control group: The patients received insulin alone therapy. a: The ratio was calculated in ng/mL. *P＜0.05 vs the same group before treatment; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs observation group after treatment. FPG: Fasting blood glucose; 2hPG: 2 h postprandial blood glucose; HbA1c: Glycosylated hemoglobin; 25(OH)D: 25-hydroxyvitamin D; BALP: Bone specific alkaline phosphatase; N-MID OC: N-terminal mid-fragment of osteocalcin; Ca/Cr: Calcium to creatinine ratio; BMD: Bone mineral density.

表 2 观察组与对照组1型糖尿病患者治疗前后血糖及骨代谢相关指标比较 Tab 2 Comparison of blood glucose and bone metabolism-related parameters of patients with type 1 diabetes mellitus between observation group and control group

由表 3可见，在观察组患者中，治疗72周后二甲双胍高剂量（1.5 g/d）组BALP、N-MID OC均高于中剂量（1.0 g/d）组及低剂量（0.5 g/d）组，差异均有统计学意义（P均 < 0.01）；在二甲双胍不同剂量组之间，25（OH）D、血清钙、血清磷、尿钙/肌酐比值、腰椎骨密度差异均无统计学意义（P均>0.05）。

表 3 (Tab 3)

表 3 不同剂量二甲双胍对1型糖尿病患者骨代谢相关指标的影响 Tab 3 Effects of different doses of metformin on bone metabolism-related parameters of patients with type 1 diabetes mellitus   x±s Index Low-dose (0.5 g·d－1) group n=20 Medium-dose (1.0 g·d－1) group n=23 High-dose (1.5 g·d－1) group n=24 P value 25(OH)D/(nmol·L－1) 41.71±18.78 46.38±16.80 44.53±15.91 0.672 BALP/(μg·L－1) 25.85±7.08 23.86±9.58 32.13±6.07**△△ 0.001 N-MID OC/(ng·mL－1) 17.74±7.52 16.62±7.11 23.74±5.10**△△ 0.001 Serum calcium/(mmol·L－1) 2.42±0.33 2.37±0.44 2.37±0.29 0.887 Serum phosphorus/(mmol·L－1) 1.38±0.33 1.41±0.34 1.45±0.25 0.789 Urinary Ca/Cra 0.14±0.06 0.12±0.07 0.11±0.06 0.219 Lumbar vertebra BMD Z value －1.17±0.99 －1.04±0.93 －1.45±0.76 0.292 a: The ratio was calculated in ng/mL. **P < 0.01 vs low-dose group; △△P < 0.01 vs medium-dose group. 25(OH)D: 25-hydroxyvitamin D; BALP: Bone specific alkaline phosphatase; N-MID OC: N-terminal mid-fragment of osteocalcin; Ca/Cr: Calcium to creatinine ratio; BMD: Bone mineral density.

表 3 不同剂量二甲双胍对1型糖尿病患者骨代谢相关指标的影响 Tab 3 Effects of different doses of metformin on bone metabolism-related parameters of patients with type 1 diabetes mellitus

以年龄、BMI、餐后2 h血糖、糖化血红蛋白、肾小球滤过率、促甲状腺激素、二甲双胍作为自变量，25（OH）D、BALP、N-MID OC、血清钙、血清磷、尿钙/肌酐比值、腰椎骨密度作为因变量进行多元线性回归分析，结果（表 4）显示，餐后2 h血糖（β=0.364，P=0.003）、二甲双胍剂量（β=0.266，P=0.035）与BALP具有正相关关系，二甲双胍剂量与N-MID OC（β=0.355，P=0.008）具有正相关关系，二甲双胍剂量与尿钙/肌酐比值（β=－0.296，P=0.026）具有负相关关系，年龄与腰椎骨密度（β=－0.820，P < 0.001）具有负相关关系。

表 4 (Tab 4)

表 4 骨代谢相关指标影响因素的多元线性回归分析 Tab 4 Multiple linear regression analysis of influencing factors of bone metabolism-related parameters Factor 25(OH)D BALP N-MID OC Serum calcium Serum phosphorus Urinary Ca/Cr Lumbar vertebra BMD β P value β P value β P value β P value β P value β P value β P value Age －0.068 0.613 0.040 0.745 －0.171 0.178 0.030 0.821 0.036 0.788 0.226 0.081 －0.820 < 0.001 BMI －0.112 0.410 －0.109 0.377 －0.051 0.690 －0.060 0.658 0.019 0.889 0.101 0.436 0.097 0.226 2hPG －0.099 0.454 0.364 0.003 0.119 0.340 －0.114 0.393 0.122 0.365 0.096 0.449 －0.028 0.721 HbA1c 0.013 0.981 －0.014 0.905 －0.028 0.819 0.226 0.084 －0.165 0.208 0.114 0.355 0.080 0.292 GFR 0.132 0.317 0.101 0.398 0.097 0.435 －0.015 0.909 0.018 0.892 －0.095 0.449 －0.017 0.827 TSH －0.146 0.270 －0.047 0.693 －0.015 0.901 0.033 0.802 －0.024 0.857 －0.091 0.468 －0.070 0.365 Metformin 0.095 0.488 0.266 0.035 0.355 0.008 0.005 0.973 0.040 0.772 －0.296 0.026 －0.117 0.149 BMI: Body mass index; 2hPG: 2 h postprandial blood glucose; HbA1c: Glycosylated hemoglobin; GFR: Glomerular filtration rate; TSH: Thyroid-stimulating hormone; 25(OH)D: 25-hydroxyvitamin D; BALP: Bone specific alkaline phosphatase; N-MID OC: N-terminal mid-fragment of osteocalcin; Ca/Cr: Calcium to creatinine ratio; BMD: Bone mineral density; β: Standardized regression coefficient.

表 4 骨代谢相关指标影响因素的多元线性回归分析 Tab 4 Multiple linear regression analysis of influencing factors of bone metabolism-related parameters

近年来，糖尿病性骨质疏松症患病率逐年升高^[15]。研究表明，糖代谢受损及胰岛素缺乏对骨代谢有诸多不利影响，会导致糖尿病患者骨代谢生化指标及骨密度降低^[16]。体外高糖环境下培养成骨细胞实验显示，高糖可增加成骨细胞碱性磷酸酶活性和表达，降低骨钙蛋白、基质金属蛋白酶13、血管内皮生长因子和GAPDH表达；高血糖和高渗状态可增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ2表达，影响成骨细胞增殖与分化^[17]。高血糖还会增高人体内炎症细胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-8等）水平，同时上调RANKL表达，它们分别介导成骨细胞凋亡和破骨细胞生成^[18-19]，而炎症因子在1型糖尿病早期升高较明显，因此上述炎症因子可能在抑制骨量积累中发挥作用^[20]。高血糖环境可产生大量晚期糖基化终末产物，干扰骨代谢，导致骨吸收增加，对骨骼产生负面影响^[21]；高尿糖亦可引起渗透性利尿，使钙、磷等由尿中大量排出，导致钙磷代谢失调，从而引起继发性甲状旁腺功能亢进症，最终导致破骨细胞活性增强^[22]。胰岛素缺乏影响骨代谢及骨密度的变化，胰岛素与成骨细胞表面胰岛素受体结合后可促进骨细胞增殖，胰岛素缺乏时骨细胞增殖受到影响；胰岛素还可抑制腺苷酸环化酶活性，减少环磷酸腺苷合成，而环磷酸腺苷可通过抑制成骨标志物（如碱性磷酸酶、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原蛋白）而刺激骨吸收，减少骨钙盐沉积。1型糖尿病患者体内胰岛素缺乏，对腺苷酸环化酶的抑制作用减弱，导致环磷酸腺苷水平升高，骨吸收作用增强^[23]。总的来说，高糖环境下骨破坏大于骨形成，导致骨重建失衡，引起骨质疏松。

二甲双胍与胰岛素联合治疗可使1型糖尿病患者在控制血糖及减少胰岛素使用剂量方面明显获益。二甲双胍可抑制肝脏葡萄糖输出，刺激肌肉对葡萄糖的吸收，增加外周组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗，进而有效降低血糖^[24]。二甲双胍对成骨细胞与破骨细胞的代谢有一定的影响，其主要通过促进骨形成及抑制骨吸收发挥作用。Kanazawa等^[8]通过动物实验研究显示，二甲双胍可显著增加骨钙蛋白和Ⅰ型胶原表达，提高碱性磷酸酶活性，并且可诱导内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）和骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）表达，促进骨细胞矿化；而AMPK抑制剂阿糖腺苷（adenine 9-β-D-arabinofuranoside，Ara-A）则可以使上述2种物质表达量明显降低。上述结果说明二甲双胍可激活AMPK信号通路，增加eNOS与BMP-2的表达，促进成骨细胞生成。另外，高血糖环境易产生大量晚期糖基化终末产物，后者抑制间充质干细胞增殖，诱导细胞凋亡，阻止同源细胞向脂肪组织、软骨和骨分化^[25]；Schurman等^[11]通过实验证明，二甲双胍可拮抗晚期糖基化终末产物，通过下调晚期糖基化终末产物受体逆转其造成的骨损害作用。此外，Liu等^[10]研究表明，二甲双胍可降低RANKL的表达，减少破骨细胞数量，增加骨保护素阳性细胞数量，使RANKL/骨保护素比值降低，从而抑制破骨细胞分化，对骨代谢起正性调节作用。Ma等^[26]通过体外实验发现，二甲双胍通过抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）活性，影响GSK3β/Wnt信号通路，显著促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。近年研究表明，二甲双胍可减轻脂多糖诱导的成骨细胞损伤，抑制Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB信号途径，且这种抑制作用与二甲双胍剂量呈正相关，而TLR4与成骨细胞增殖、分化呈负相关，因此二甲双胍通过上述途径保护骨形成^[27]。Mu等^[28]通过动物实验发现，二甲双胍在高糖条件下通过增加沉默信息调节蛋白6（silent information regulator-6，SIRT6）的表达抑制NF-κB磷酸化，进而下调八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）的表达，促进小鼠成骨细胞增殖和分化。总的来说，关于二甲双胍在高糖环境下影响骨代谢的分子调控机制的研究较多，但是由于1型糖尿病患者较少，使用二甲双胍治疗者更少，因此二甲双胍影响1型糖尿病患者骨代谢的临床研究报道很少。

本研究结果显示，观察组在使用二甲双胍联合胰岛素治疗72周后，骨形成标志物BALP、N-MID OC水平及腰椎骨密度均高于单纯使用胰岛素治疗的对照组，并且观察组和对照组患者治疗后的空腹血糖、餐后2 h血糖及糖化血红蛋白差异无统计学意义，因此排除了血糖对骨代谢的影响。将观察组患者根据二甲双胍剂量分为低剂量（0.5 g/d）组、中剂量（1.0 g/d）组、高剂量（1.5 g/d）组比较发现，当二甲双胍剂量维持在高剂量时，BALP、N-MID OC水平高于中剂量组和低剂量组。多元线性回归分析发现，二甲双胍剂量与骨形成标志物BALP（β=0.266，P=0.035）、N-MID OC（β=0.355，P=0.008）具有正相关关系，与骨吸收指标尿钙/肌酐比值（β=－0.296，P=0.026）具有负相关关系，提示二甲双胍具有一定的促进骨形成及抑制骨吸收的作用。本研究结果还显示，观察组使用二甲双胍治疗72周后腰椎骨密度水平有了一定的提高，但是与二甲双胍剂量无关；并且观察组整体骨密度Z值虽有所提升，但其中已诊断为骨质疏松症的患者（共12例）骨密度并未显著提升（治疗前腰椎骨密度Z值为－2.48±0.21，治疗后为－2.32±0.27，P=0.31）。因此，二甲双胍的作用可能主要在于加强骨形成及预防骨质疏松的发生。通过多元线性回归分析还发现，腰椎骨密度与年龄（β=－0.820，P < 0.001）具有负相关关系，验证了骨密度随着年龄增长逐渐下降；BALP与餐后2 h血糖呈正相关关系（β=0.364，P=0.003），提示高血糖环境可增加碱性磷酸酶的表达，这与先前研究结果^[17]一致。此外，本研究结果显示观察组与对照组25（OH）D、血清钙、血清磷水平差异无统计学意义，推测可能因为钙磷调节主要与降钙素、甲状旁腺激素、维生素D有关，二甲双胍并未直接参与其调节。

目前关于2型糖尿病性骨质疏松症患者使用二甲双胍后对骨代谢的影响方面的研究较多，从流行病学调查到基础研究均证实二甲双胍能够促进骨形成，防止骨折发生^[29]；但是也有不同的研究结果，有研究发现二甲双胍对成骨细胞和破骨细胞没有作用^[30]。由于临床上使用二甲双胍治疗的1型糖尿病患者相对较少，因此二甲双胍影响1型糖尿病患者骨代谢的研究也很少。本研究通过回顾性临床观察研究探讨了二甲双胍对1型糖尿病患者骨代谢的影响，由于样本量较小，缺乏长期随访，并且在随访时少部分患者对既往是否漏服二甲双胍可能有信息偏倚，因此研究结果具有一定的局限性。

总之，本研究结果显示二甲双胍可明显提高1型糖尿病患者骨形成标志物BALP、N-MID OC水平，增加腰椎骨密度，提示二甲双胍可通过增加骨形成减少1型糖尿病性骨质疏松症的发生。二甲双胍联合胰岛素治疗1型糖尿病除对血糖控制获益外，也对患者骨代谢有一定的作用，可能有助于预防糖尿病性骨质疏松症。