2021, Vol. 42
, KONG JieΔ, LU Xiao-ling, SUN Xiao, YU Hao-bing, LIANG Zhen-zhen, XU Yao, DENG Bo-wen, JIAO Bing-hua
海洋覆盖着地球表面积的71%，海洋微生物所处的特殊环境导致了其物种的多样性，这种物种的多样性构成了抗肿瘤天然药物化学多样性的基础[1]。随着提取分离技术和药物筛选手段的不断进步和发展，越来越多来自海洋微生物的代谢产物被发现具有体内外抗肿瘤活性。目前已经上市的海洋药物中有4种具有抗肿瘤作用，分别为甲磺酸艾立布林（eribulin mesylate，E7389；商品名：海乐卫）、ω-3-酸乙酯（omega-3-acid ethyl esters）、曲贝替定（trabectedin，ET-743）和本妥昔单抗（brentuximab vedotin，SGN-35）。海洋微生物来源的天然产物及其结构类似物因其特异的化学结构和良好的抗肿瘤活性成为抗肿瘤药物开发的重要来源[2]，具有广阔的应用前景。
乳腺癌是女性发病率最高、最常见的恶性肿瘤。WHO国际癌症研究机构发布了2018年全球癌症负担数据，全球女性有超过208万乳腺癌新发病例，居女性恶性肿瘤发病率的首位；死于乳腺癌的女性患者约有62万例，也位于女性恶性肿瘤病死率的首位[3]。乳腺癌的分子分型有Luminal A型、Luminal B型、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）过表达型、基底样型/三阴性（雌激素受体、孕激素受体和HER2均为阴性）及特殊类型，其中三阴性乳腺癌占比约为12.7%[4]。三阴性乳腺癌的治疗进展一直落后于其他分子分型，迄今为止主要局限于化学治疗[5]。虽然目前有几种免疫疗法和靶向疗法正在研究中，但由于三阴性乳腺癌包含一系列异质性的分子结构，这些疗法只对部分患者有效[6]。所以积极寻找三阴性乳腺癌新的作用靶点及新的化学治疗药物仍然十分必要。
隆纳霉素（loongmycin）是从海洋放线菌NA01583中分离得到的新的次级代谢产物，属于蝴蝶霉素（图 1）类似物，在前期的研究中，隆纳霉素对人乳腺癌细胞MDA-MB-468、MDA-MB-231表现出良好的细胞毒性。蝴蝶霉素是一种吲哚咔唑类的新型天然抗生素，其类似物能够结合在DNA与拓扑异构酶Ⅰ形成的复合物上抑制DNA链切口处的重连接[7]，引起DNA单链和双链断裂，从而产生较强的抗肿瘤活性。但蝴蝶霉素水溶性较差，影响其进一步的体内药理活性评价，目前仅有巴特卡令（becatecarin）[8]、edotecacin[9-10]和NSC#655649[11]3种蝴蝶霉素类似物药物进入临床研究。隆纳霉素较蝴蝶霉素多了一个稀有糖基，增加了其水溶性，具有更好的成药潜力。
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图 1 蝴蝶霉素（A）与隆纳霉素（B）的化学结构 Fig 1 Structures of rebeccamycin (A) and loongmycin (B) |
转录组测序技术（RNA-seq）能够反映生物体在某一特定时空条件下基因的表达情况。通过分析测序数据的差异表达基因、功能富集等定位肿瘤发生和发展、药物处理等情况下的细胞生物学通路，或许能筛选出具有生物学意义的靶基因。本研究利用转录组测序技术初步筛选在隆纳霉素抑制三阴性乳腺癌细胞系增殖过程中起关键作用的通路和基因，为进一步研究其治疗靶作用提供参考。
1 材料和方法 1.1 细胞、试剂与仪器 1.1.1 细胞系人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468（货号TCHu136）购至上海生物化学与细胞生物学细胞库。
1.1.2 药品和试剂隆纳霉素由南京大学戈惠明课题组提供。链霉素/青霉素混合液、0.25%胰酶+0.2% EDTA溶液、FBS均购自美国Gibco公司。RPMI-1640培养基购自美国HyClone公司。膜联蛋白（annexin）Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒、DMSO均购自美国Origen公司。BCA蛋白定量试剂盒购自英国Abcam公司。甲醇溶液（分析纯）购自中国国药集团。PBS、十二烷基硫酸钠上样缓冲液购自生工生物工程（上海）股份有限公司。CCK-8试剂[2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2, 4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐]购自美国Sigma公司。
转录组测序工作由上海吉凯基因医学科技股份有限公司完成，其中M-MuLV反转录酶反应体系、核糖核酸酶H、DNA聚合酶Ⅰ均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，AMPure XP磁珠购自美国Beckman公司，测序文库构建使用试剂盒为美国Illumina公司的第二代测序RNA文库制备试剂盒（NEBNext® UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina®）。
1.1.3 主要仪器及耗材超净工作台（深圳市九鼎净化设备有限公司），CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司），HERACELL150i型细胞培养箱（美国Thermo公司），5417R型小型台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司），Invitrogen Countess型细胞计数仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪（美国BD公司），超高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司），HiSeq X ten PE150 NovaSeq 6000型第二代测序分析仪（美国Illumina公司）。
75 cm2一次性细胞培养瓶、25 cm2一次性细胞培养瓶、96孔板、6孔板均购自美国ThermoFisher公司。各规格离心管购自美国Corning公司。细胞计数板购自上海拜力生物科技有限公司。
1.2 细胞培养MDA-MB-468细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养至贴壁。
1.3 CCK-8法检测隆纳霉素对细胞生长曲线的影响取贴壁MDA-MB-468细胞，用含EDTA的胰酶消化后，培养基洗涤稀释至5×105/mL，每孔100 μL接种于2块96孔板内，分别标记为48和72 h处理组。置于饱和湿度细胞培养箱（37 ℃、5% CO2）培养过夜。将培养基换为加药培养基100 μL，根据药物终浓度设阴性对照组（含体积分数为0.06% DMSO的PBS）及不同浓度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L）的隆纳霉素处理组，每组设置3个复孔。分别培养48和72 h后加入10 μL CCK-8试剂，反应1 h后置于摇床轻度震荡5 min，然后将96孔板置于酶标仪中，测定450 nm波长处光密度值（D450），计算各组肿瘤细胞的存活率：细胞存活率（%）=（隆纳霉素处理组D450-空白对照组D450）/（阴性对照组D450-空白对照组D450）×100%，其中空白对照组为加入CCK-8试剂、不含肿瘤细胞株和隆纳霉素的培养基。计算各肿瘤细胞株的IC50，实验重复3次。此处以IC50作为药物作用效果的评价指标，其含义为在该处理时长下细胞增殖抑制率达到50%时所用药物的浓度。
1.4 流式细胞术检测隆纳霉素对细胞周期的影响应用流式细胞仪，采用膜联蛋白Ⅴ-FITC/PI双标法检测隆纳霉素对MDA-MB-468细胞周期的影响。取培养24 h的MDA-MB-468细胞接种至6孔板，每孔1×106个细胞。待细胞贴壁后弃上清液，实验组加入含浓度为0.4和0.8 μmol/L隆纳霉素的培养基，孵育48 h后收集5×105个细胞。然后加入500 μL的结合缓冲液充分混匀，重悬细胞后加入2.5 μL膜联蛋白Ⅴ-FITC溶液充分混匀，再加入2.5 μL PI混匀。放置于室温、避光环境中反应15 min，立即用流式细胞仪检测细胞周期。应用SPSS 22.0软件，采用单因素方差分析进行数据比较，检验水准（α）为0.05。
1.5 送测序样本制备将处于对数生长期的细胞用0.25%的胰酶消化，接种至6孔板。每孔接种约1×105个细胞。培养12 h后换成含浓度为0.8 μmol/L隆纳霉素的培养基，继续培养48 h后，与不加药对照组各3个复孔的细胞，经TRIzol试剂破碎和裂解后，交由上海吉凯基因医学科技股份有限公司进行RNA提取、质量控制、建立测序文库和转录组测序。
1.6 RNA的提取、检测、测序文库构建及转录组测序将细胞在液氮中研磨成粉末，使用TRIzol试剂提取总RNA，并用DNA酶Ⅰ去除基因组DNA。使用2100型生物分析仪（安捷伦科技有限公司上海分公司）检测RNA完整性。
利用第二代测序RNA文库制备试剂盒，按照说明书方法构建测序文库。以mRNA片段化产物为模板，添加随机寡核苷酸引物，在M-MuLV反转录酶反应体系中得到cDNA第1条链。用核糖核酸酶H降解杂合双链中的RNA链，并在DNA聚合酶Ⅰ体系下，以dNTP为原料合成cDNA第2条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复、加A尾并连接测序接头，用AMPure XP磁珠筛选长度为250~300 bp的cDNA，以此为模板进行PCR扩增。再次使用AMPure XP磁珠纯化PCR产物获得测序文库。
对获得的测序文库先使用Qubit 2.0荧光计进行初步定量，根据定量结果，将测序文库稀释至1.5 ng/μL，然后使用2100型生物分析仪检测文库的有效测序片段长度，符合250~300 bp，正态分布标准化后，用qRT-PCR定量文库的有效浓度，确保文库有效浓度高于2 nmol/L。文库检验合格后，上机测序。
1.7 质量控制、数据组装及基因功能注释对原始数据进行过滤，主要包括去除测序片段的接头序列、去除含无法确定的碱基信息的测序片段、去除低质量测序片段。Illumina®平台测序结果的碱基质量值用Qphred表示，其计算公式为Qphred=-10lge，其中e表示碱基测序错误率。将Qphred≤20碱基数占全长50%的片段判为低质量，同时统计Q20所占比例。之后，对过滤后数据进行Q30和GC含量计算，进一步确认测序数据质量。后续所有分析均基于此处过滤得到的数据进行。
应用HISAT2 2.0.5软件将配对末端测序片段与参照基因组（Species: Humangenes GRCh38.p12）比对。采用StringTie 1.3.3b软件进行新基因预测。使用featureCounts 1.5.0-p3软件计算映射到每个基因的读数，该部分处理均采用软件推荐的默认参数。然后根据基因长度计算每个基因的每千个碱基的转录每百万映射读取的片段数（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM），基因表达的阈值定为1，计算映射到该基因的读数，得到表达值矩阵。
1.8 差异表达基因分析与功能富集使用DESeq2 1.16.1软件[12]进行组间差异表达基因分析（每组设3个生物学重复）。标准化方法为DESeq标准算法，使用基于负二项式分布的P值计算模型确定基因表达数据中的差异表达，筛选标准定为错误发现率（false discovery rate，FDR）≤0.05且log2|FC|≥1或≤-1，其中FC为基因表达变化的差异倍数（fold change）。使用Benjamini-Hochberg方法校正P值以控制FDR。通过clusterProfiler 3.4.4软件实现差异表达基因的基因本体（Gene Ontology，GO）分析[13-14]和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）[15]通路富集分析，其中修正了基因长度偏差。以上分析基于R 3.6.0软件实现。考虑校正的P值＜0.05的通路差异表达基因显著富集，基于基因集做排列检验（permutation test）并进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）[16]。
1.9 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interacton，PPI）网络构建及枢纽基因（hub-gene）筛选将差异表达基因输入到STRING在线工具（https://string-db.org/）[17]进行PPI分析，将节点信息导入Cytoscape 3.7.2软件，采用其中的分子复合物检测（molecular complex detection，MCODE）扩展包2.0.0[17]进行枢纽基因分析。
1.10 多数据库交叉比较取表达差异倍数较大的前400个基因，通过查找MalaCards（https://www.malacards.org）、GeneCards（https://www.genecards.org）、癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA；https://portal.gdc.cancer.gov）数据库，鉴定是否已有文献报道这些基因与乳腺癌相关。
1.11 药物-靶蛋白对接分析使用PyMOL 2.4.1软件[18]和AutoDock 1.5.6软件[19]进行分子对接预测。使用ChemDraw 19软件绘制并导出隆纳霉素分子数据，从ZINC数据库（http://zinc.docking.org）下载蝴蝶霉素分子数据，登记号为ZINC28520217。从RCSB蛋白数据库（https://www.rcsb.org）获取20S蛋白酶体β亚单位5（proteasome 20S subunit beta 5，PSMB5；DOI：10.2210/pdb6RGQ/pdb）和含有SET结构域7的组蛋白赖氨酸甲基转移酶（SET domain containing 7 histone lysine methyltransferase，SETD7；DOI：10.2210/pdb4JLG/pdb）蛋白及DNA分子结构（DOI：10.2210/pdb1SC7/pdb）。
2 结果 2.1 隆纳霉素对细胞活性及细胞周期的影响隆纳霉素对人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞作用48、72 h，均表现出较高的细胞毒性，且具有浓度依赖性（图 2A）。隆纳霉素处理48、72 h后，拟合计算该细胞系的IC50，分别为2.733和0.866 μmol/L。考虑到误差及药物代谢情况，选取用药时长48 h进行实验，设置0.4和0.8 μmol/L 2个浓度进行流式细胞术检测，结果显示隆纳霉素对MDA-MB-468细胞有周期阻滞作用，且在0.8 μmol/L浓度下与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05，图 2B），故选取0.8 μmol/L隆纳霉素处理48 h的细胞进行转录组测序。
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图 2 隆纳霉素对人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞活性及细胞周期的影响 Fig 2 Effect of loongmycin on activity and cell cycle of human triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-468 cells A: Cell counting kit 8 assay results revealed that the cytotoxic activity showed a concentration dependent manner after 48 and 72 h of loongmycin treatment; B: Flow cytometry results revealed that loongmycin arrested MDA-MB-468 cells in G2/M phase, with significant difference at 0.8 μmol/L (P<0.05). n=3, x±s. |
2.2 差异表达基因筛选
按照FDR≤0.05和log2|FC|≥1或≤-1的标准共筛选出1 764个差异表达基因（图 3A），与对照组相比，隆纳霉素处理组上调基因737个、下调基因1 027个。差异结果热图及聚类（图 3B）显示，样本分组聚类符合实验设计，组间差异大于组内差异，其中表达上调的前10个基因是IL-6、海马钙蛋白样蛋白4（hippocalcin like 4，HPCAL4）、角蛋白相关蛋白3-1（keratin-associated protein 3-1，KRTAP3-1）、胃泌素（gastrin，GAST）、嗅觉受体家族2亚家族H成员2（olfactory receptor family 2 subfamily H member 2，OR2H2）、新转录本AC117394.2和AC002480.1、上池蛋白（suprabasin，SBSN）、新转录本AL133444.1、胶原Ⅵ型α2链蛋白（collagen type Ⅵ alpha 2 chain，COL6A2），表达下调的前10个基因是肌聚糖蛋白δ（sarcoglycan delta，SGCD）、新转录本AC027312.1、甘氨酸受体α3（glycine receptor alpha 3，GLRA3）、Nanog同源异形假基因7（Nanog homeobox pseudogene 7，NANOGP7）、钙黏着蛋白17（cadherin 17，CDH17）、长链非编码RNA 1630（long intergenic non-protein coding RNA 1630，LINC01630）及新转录本AC095055.1、AL606534.1、FP236383.2、AP001381.1。
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图 3 隆纳霉素处理组与对照组人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞差异表达基因筛选 Fig 3 Differentially expressed genes of human triple-negative breast cancer cell line MDA-MB-468 cells in loongmycin group compared with control group A: Compared with the control group, there were 737 up-regulated genes and 1 027 down-regulated genes in the loongmycin group (the vertical dashed lines indicate log2|FC|=-1 or 1, and horizontal dashed line indicates Padj=0.05); B: Heat map and clustering of differentially expressed genes showed that the sample clustering conformed to the experimental design, and the differences between groups are greater than the differences within the groups (_1, _2 and _3 represent different samples). Padj: P value adjusted for multiple testing using Benjamini-Hochberg to estimate the false discovery rate; FC: Fold change. |
2.3 差异表达基因功能分析
GO分析（图 4）提示，表达下调的基因在突触后膜明显富集，主要参与神经突触信号转导，在分子功能方面主要与肌动蛋白结合及离子门控通道有关；表达上调的基因主要在细胞外基质相关条目富集，多参与信号受体活性调节、内皮细胞增殖调控、细胞运动等生物学过程，在分子功能方面主要富集于受体-配体活性调节相关条目。KEGG分析结果（图 5）显示，下调表达的基因主要集中于神经相关功能通路及Ras相关蛋白1（Ras-related protein 1，RAP1）信号通路，上调表达的基因主要集中于细胞因子-受体相互作用过程。
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图 4 差异表达基因的基因本体功能分析 Fig 4 Gene Ontology analysis of differentially expressed genes A: Down-regulated genes; B: Up-regulated genes. Padj: P value adjusted for multiple testing using Benjamini-Hochberg to estimate the false discovery rate; GTPase: Guanosine triphosphatase; GABA: Gamma-aminobutyric acid; MHC: Major histocompatibility complex; CXCR: C-X-C motif chemokine receptor. |
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图 5 差异表达基因KEGG富集分析 Fig 5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes A: Down-regulated genes; B: Up-regulated genes. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; Padj: P value adjusted for multiple testing using Benjamini-Hochberg to estimate the false discovery rate; COA: Coenzyme A; GABA: Gamma-aminobutyric acid; RAP1: Ras-related protein 1; TRP: Transient receptor potential; PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase; Akt: Protein kinase B; ECM: Extracellular matrix; JAK: Janus kinase; STAT: Signal transducers and activators of transcription; TNF: Tumor necrosis factor; IL-17: Interleukin 17. |
2.4 GSEA结果
以标志基因集为探索集的GSEA结果（图 6A、6B）显示，隆纳霉素处理组NF-κB介导的TNF-α信号通路及P53信号通路存在上调。以调控靶基因集为探索集的GSEA结果（图 6C、6D）显示，隆纳霉素处理组基因的表达差异可能主要受PSMB5和SETD7调控。
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图 6 差异表达基因GSEA结果 Fig 6 GSEA results of differentially expressed genes A: Enrichment plot of hall mark TNF-α signaling via NF-κB; B: Enrichment plot of hall mark P53 pathway; C: Enrichment plot of PSMB5 target genes; D: Enrichment plot of SETD7 target genes. GSEA: Gene set enrichment analysis; TNF-α: Tumor necrosis factor alpha; NF-κB: Nuclear factor kappa B; PSMB5: Proteasome 20S subunit beta 5; SETD7: SET domain containing 7 histone lysine methyltransferase. |
2.5 PPI网络及枢纽基因获取
通过MCODE筛选出MCODE得分排前3位的3个枢纽模块，提取各模块得分排前5位的基因，分别为G蛋白γ亚基（G protein subunit gamma，GNG）11、GNG7、C-X-C基序趋化因子配体（C-X-C motif chemokine ligand，CXCL）8、腺苷酸环化酶2（adenylate cyclase 2，ADCY2）、CXCL1，骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）、载脂蛋白E（apolipoprotein E，APOE）、富半胱氨酸血管生成诱导因子61（cysteine rich angiogenic inducer 61，CYR61）、潜在转化生长因子β结合蛋白1（latent transforming growth factor beta binding protein 1，LTBP1）、纤维蛋白原α链（fibrinogen alpha chain，FGA），以及核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶（ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase，ENPP）3、ENPP1、腺苷酸激酶9（adenylate kinase 9，AK9）、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）1C、PDE1A。
2.6 基于多数据库的乳腺癌相关基因筛选通过查阅文献并参考人类疾病数据库MalaCards，人工筛选出27个乳腺癌相关差异表达基因，分别为神经元五聚蛋白1（neuronal pentraxin 1，NPTX1）、小核仁RNA C/D盒蛋白104（small nucleolar RNA C/D box 104，SNORD104）、LY6/PLAUR结构域蛋白1（LY6/PLAUR domain containing 1，LYPD1）、CXCL5、Ras相关地塞米松诱导蛋白1（Ras related dexamethasone induced 1，RASD1）、SBSN、维甲酸代谢早期转录本1L（retinoic acid early transcript 1L，RAET1L）、亨廷顿蛋白相关蛋白1（huntingtin-associated protein 1，HAP1）、肌动蛋白集束蛋白1（fascin actin-bundling protein 1，FSCN1）、生殖细胞碱性磷酸酶（alkaline phosphatase germ cell，ALPG）、神经生长因子受体（nerve growth factor receptor，NGFR）、组织因子途径抑制蛋白2（tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI2）、G蛋白调节诱导神经突增生蛋白3（GPRIN family member 3，GPRIN3）、清道夫受体A5（scavenger receptor class A member 5，SCARA5）、肝细胞黏附分子2（HEPACAM family member 2，HEPACAM2）、奇跳相关转录因子1（odd-skipped related transciption factor 1，OSR1）、雌激素受体γ（estrogen-related receptor gamma，ESRRG）、核受体亚家族2F1反义RNA1（NR2F1 antisense RNA 1，NR2F1-AS1）、SGCD、kit原癌基因受体酪氨酸蛋白激酶（kit proto-oncogene receptor tyrosine kinase，KIT）、脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）、γ-氨基丁酸A受体π亚基（gamma-aminobutyric acid type A receptor pi subunit，GABRP）、ENPP3、G蛋白偶联受体55（G protein-coupled receptor 55，GPRP55）、PDE1C、含三联基序63蛋白（tripartite motif containing 63，TRIM63）、三磷酸肌醇相互作用结构域1蛋白（ITPR interacting domain containing 1，ITPRID1）。在隆纳霉素处理组HAP1（log2|FC|=3.560）及FSCN1（log2|FC|=4.029）表达显著增加，KIT（log2|FC|=-3.573）与GABRP（log2|FC|=-3.746）表达显著下降。
2.7 分子对接分析隆纳霉素和蝴蝶霉素对DNA分子的结合能分别为-5.19和-3.52 kcal/mol（1 kcal=4.186 kJ）。隆纳霉素与PSMB5第81位的丙氨酸和第84位的酪氨酸作用，结合能为-7.22 kcal/mol；与SETD7第340位的丝氨酸作用，结合能为-6.43 kcal/mol。蝴蝶霉素与PSMB5第128位的天冬氨酸和第125位的酪氨酸作用，结合能为-3.58 kcal/mol；与SETD7的结合能为-2.77 kcal/mol，无明显作用位点（图 7）。
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图 7 隆纳霉素及蝴蝶霉素分别与DNA、PSMB5、SETD7分子对接示意图 Fig 7 Rigid molecular docking of loongmycin or rebeccamycin with DNA, PSMB5 and SETD7 PSMB5: Proteasome 20S subunit beta 5; SETD7: SET domain containing 7 histone lysine methyltransferase. |
3 讨论
本实验分析结果提示NF-κB介导的TNF-α信号通路及P53信号通路可能是隆纳霉素作用通路，参与调节的上游蛋白为PSMB5和SETD7。分子对接结果显示，相比蝴蝶霉素，隆纳霉素分子能够更好地插入DNA分子内，起到抑制拓扑异构酶功能的作用，且隆纳霉素与DNA片段及差异表达基因潜在的关键调节蛋白PSMB5和SETD7具有相互作用。
TNF是一种重要的细胞因子，可诱导多种细胞内信号通路，包括细胞凋亡、细胞存活及炎症和免疫。活化的TNF被组装到一个同型三聚体上，并与其受体（TNF受体1、2）结合，TNF受体1可诱导许多基因的激活，主要受2个不同的通路调控，其中NF-κB通路导致凋亡、MAPK级联反应引起坏死。TNF受体2激活NF-κB通路，包括PI3K依赖的NF-κB通路和JNK通路，促进细胞维持生存状态。隆纳霉素作用于人三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞后，IL-6等炎症因子及CXCL1等趋化因子的表达增加，符合TNF受体1介导的信号调节结果。
DNA损伤、氧化应激和激活的致癌基因等应激信号能够激活P53。P53蛋白被用作P53调控基因的转录激活因子，能够导致细胞周期阻滞、衰老或凋亡。推测隆纳霉素能够促进P53上调从而导致癌细胞G2/M阻滞。
PSMB5是一个多催化功能的蛋白酶体复合物，催化非溶酶体依赖性蛋白质裂解，其在乳腺癌组织中高表达且与较差的预后相关[20]。研究表明，PSMB5对三阴性乳腺癌细胞的增殖及抗药性有促进作用[21]。结合本实验结果，推测PSMB5是隆纳霉素发挥作用的关键靶点之一，隆纳霉素能够通过与其结合抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-468细胞的增殖。
SETD7是一种甲基转移酶，催化组蛋白H3的第4位赖氨酸单甲基化，是表观遗传转录激活的特殊标志。SETD7也具有对P53等非组蛋白的甲基转移酶活性，在终末分化的细胞重新进入细胞周期后表达上调[22]。研究表明SETD7低表达乳腺癌患者的中位生存时间（18.1年）约为SETD7高表达患者（9.5年）的2倍[23]。以上结果提示，隆纳霉素可能通过与SETD7结合抑制后者发挥功能。
另外，基于多数据库的基因筛选结果提示，乳腺癌患者的HAP1、FSCN1、KIT和GABRP等基因表达的变化也应予以关注。
根据分析结果推测：（1）隆纳霉素具有与蝴蝶霉素类似的生物学功能，其通过与DNA-拓扑异构酶Ⅰ复合物中的DNA分子结合发挥抗肿瘤活性。（2）隆纳霉素可通过与基因表达调节蛋白PSMB5和SETD7结合，影响GNG7、GNG11、CXCL8、ADCY2等基因的表达水平，从而上调NF-κB介导的TNF-α通路和P53通路，最终导致MDA-MB-468细胞G2/M阻滞，发挥抗肿瘤作用。
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