新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的疾病，该病传染性强，传播范围广，目前没有特效治疗药物。中医药是中国医药学的宝库，其抗疫经验丰富，在《黄帝内经》时期就有了疫病的概念。国家卫生健康委员会在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中明确提出了中医治疗方案。中医学认为COVID-19属于"疫毒"的范畴，病性为湿热，病位在肺、脾，基本病机为"湿、热、瘀、虚"，早期COVID-19患者证型主要为"风热袭表"，主要症状为发热、干咳，伴有痰少、咽痛、口干不欲多饮等^[1]，因此可以应用荆防解表、银翘清热。荆银合剂是由上海名中医王左教授根据中医学"疏风解表、清热解毒"治则及临床经验拟定的处方，包含了荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、蒲公英、牛蒡子、防风、甘草9味中药，已在临床应用了40多年，对于轻症上呼吸道感染具有明确疗效^[2-4]，目前作为抗COVID-19上海方案中的推荐药物使用^[5]。方中荆芥、防风解表散邪，金银花、大青叶、蒲公英清热解毒，牛蒡子、鱼腥草、四季青清肺止咳，甘草调和药性，总体发挥疏散风热、清肺止咳的作用。该药已在雷神山医院、部分方舱医院使用^[6]。本研究采用网络药理学与分子对接的方法探讨荆银合剂干预COVID-19的作用机制，以期为临床应用该药提供理论依据。

本研究采用计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索中药荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、牛蒡子、防风、甘草的活性成分；TCMSP数据库中未收录蒲公英，故通过文献检索获取蒲公英的活性成分^[7-8]。根据化合物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)与类药性(drug likeness，DL)进行筛选，OB阈值设为≥30%，DL阈值设为≥0.18，并采用TCMSP数据库获得活性成分对应的靶点。利用GeneCard数据库获取与COVID-19直接相关的靶点。

为明确疾病相关靶点与荆银合剂相关靶点之间的关系，将上述两部分靶点进行交集，输入Cytoscape 3.6.1软件构建出化合物-靶点网络。Cytoscape软件的核心架构是网络，节点是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接代表这些生物分子之间的相互作用，节点度代表网络中与节点相连的边的总数目。

为更深层次地探究靶点蛋白质之间的相互作用，将统计所得的疾病-药物靶点基因上传至在线STRING 10.5软件(http://stringdb.org)，构建PPI网络模型。物种选择为人(homosapiens)，参数保持默认设置。

利用R 3.6软件中的org.Hs.eg.db包(http://www.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html)将基因命名(symbol)转变为Entrez ID，进而利用clusterProfiler包(http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html)对网络进行基因本体(gene ontology，GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，保存结果。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶点数目进行排序，筛选GO中分子功能、细胞组分和生物过程的前15个条目及KEGG富集的前20个信号通路。

从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载SARS-CoV-2的3CL水解酶和SARS-CoV-2核衣壳蛋白的三维晶体结构(PDB ID为6LU7和6M3M，pdb格式)，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载槲皮素、木樨草素的三维结构(CAS号为117-39-5和491-70-3，pdb格式)，采用AutoDock Tools 1.5.6软件删除靶蛋白的水分子，分离配体和受体，添加非极性氢，计算Gasteiger电荷，分别保存为pdbqt格式文件。将已经保存为pdb格式的化合物导入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，保存为pdbqt格式，作为对接配体。运行AutoDock Vina 1.1.2软件进行对接并将结果可视化。

通过TCMSP检索到荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、牛蒡子、防风、甘草中化合物共1 125个，其中159个来自荆芥、236个来自金银花、38个来自四季青、50个来自鱼腥草、45个来自大青叶、144个来自牛蒡子、173个来自防风、280个来自甘草。筛选出OB≥30%且DL≥0.18的化合物171个，其中11个来自荆芥、23个来自金银花、5个来自四季青、7个来自鱼腥草、10个来自大青叶、8个来自牛蒡子、15个来自防风、92个来自甘草，去除不同中药中相同化合物共获取化合物136种。通过查阅文献获取蒲公英中化合物共73个，将其逐个输入TCMSP，按照上述标准进行筛选，共获取13个化合物。再去除重复的化合物后，共发现荆银合剂中活性物质141个，可入血的活性成分120个，并获取对应的药物成分靶点共232个，部分化合物见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 荆银合剂部分活性成分 Tab 1 Several active components in Jingyin mixture MOLID Name OB DL MOL000006 Luteolin 36.16 0.25 MOL000098 Quercetin 46.43 0.28 MOL000173 Wogonin 30.68 0.23 MOL000211 Mairin 55.38 0.78 MOL000239 Jaranol 50.83 0.29 MOL000354 Isorhamnetin 49.60 0.31 MOL000358 β-sitosterol 36.91 0.75 MOL000359 Sitosterol 36.91 0.75 MOL000392 Formononetin 69.67 0.21 MOL000417 Calycosin 47.75 0.24 MOL000422 Kaempferol 41.88 0.24 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000497 Licochalcone A 40.79 0.29 MOL000500 Vestitol 74.66 0.21 MOL000522 Arctiin 34.45 0.84 MOL001484 Inermine 75.18 0.54 MOL001494 Mandenol 42.00 0.19 MOL001495 Ethyl linolenate 46.10 0.20 MOL001781 Indigo 38.20 0.26 MOL001941 Ammidin 34.55 0.22 MOL001942 Isoimperatorin 45.46 0.23 MOL002045 Stigmasterol 43.41 0.76 MOL002309 Indirubin 48.59 0.26 MOL002311 Glycyrol 90.78 0.67 MOL002320 γ-sitosterol 36.91 0.75 MOL002322 Isovitexin 31.29 0.72 MOL002565 Medicarpin 49.22 0.34 MOL002644 Phellopterin 40.19 0.28 MOL002680 Flavoxanthin 60.41 0.56 MOL002773 β-carotene 37.18 0.58 MOL002881 Diosmetin 31.14 0.27 MOL003128 Dinethylsecologanoside 48.46 0.48 MOL003578 Cycloartenol 38.69 0.78 MOL003588 Prangenidin 36.31 0.22 MOL003656 Lupiwighteone 51.64 0.37 MOL003851 Isoramanone 39.97 0.51 MOL004328 Naringenin 59.29 0.21 MOL004355 Spinasterol 42.98 0.76 MOL004814 Isotrifoliol 31.94 0.42 MOL004855 Licoricone 63.58 0.47 MOL004903 Liquiritin 65.69 0.74 MOLID: Molecule identity document; OB: Oral bioavailability; DL: Drug likeness.

表 1 荆银合剂部分活性成分 Tab 1 Several active components in Jingyin mixture

从GeneCard数据库中获得350个与COVID-19直接相关的靶基因。采用Cytoscape 3.6.1软件构建的化合物-靶点网络包含120个化合物节点、47个靶点节点和461条边，用红色矩形表示化合物，绿色椭圆形表示靶点，连接化合物与靶点的边表示两者之间有作用关系(图 1)。

图 1 荆银合剂主要成分-靶点网络 Fig 1 Network of main compound-targets of Jingyin mixture

依据网络拓扑学性质可知，有较多节点的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。排名前10位的化合物依次为槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、甘草查尔酮A(licochalcone A)、靛玉红(indirubin)、芒柄花黄素(formononetin)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、异鼠李素(isorhamnetin)，分别能与38、18、13、13、11、9、7、7、7、6个靶点蛋白发生作用。从靶点的角度看，节点度排名前5位的是前列腺素过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)2、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor γ，PPARG)、PTGS1、MAPK14，分别能与114、76、71、57和50个化合物发生相互作用，体现了中药多靶点的特性。

应用STRING 10.5软件构建PPI网络(图 2)，在此网络图中包含47个节点、254条边，同时得到网络中关键靶点的节点度，并计算得到均值为27.659。根据节点度＞27.659筛选出关键节点28个，按节点度从大到小排列依次为IL-6、MAPK3、MAPK8、caspase(CASP)3、IL-10、白蛋白(albumin，ALB)、趋化因子C-X-C模序配体(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL)8、MAPK1、趋化因子C-C模序配体(C-C motif chemokine ligand，CCL)2、IL-1B、PTGS2、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-4、细胞内黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM1)、MAPK14、低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)、IL-2、v-rel网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A(v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A，RELA)、CASP8、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)、B细胞淋巴瘤2样蛋白1(B cell lymphoma 2-like protein 1，BCL2L1)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)、NOS2、CCL5、PPARG、CXCL10。这些节点度较大的靶点在PPI网络中起着关键作用，可能是荆银合剂治疗COVID-19的关键靶点。

图 2 荆银合剂靶点蛋白质-蛋白质相互作用网络 Fig 2 Protein-protein interaction network of the targets of Jingyin mixture

上述基因靶点的GO生物过程主要包括对脂多糖的反应、对脂多糖的细胞反应、对氧化应激的反应、对机械刺激的反应及对金属离子的反应等，分子功能包括细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、趋化因子受体结合及趋化因子活性，并且参与了细胞膜及细胞器膜结构的组成(图 3)。

图 3 荆银合剂干预COVID-19的GO富集分析 Fig 3 GO enrichment analysis of COVID-19 treated with Jingyin mixture COVID-19: Coronavirus disease 2019; GO: Gene ontology.

KEGG富集的前20个信号通路(图 4)主要包括细胞-细胞因子受体相互作用、低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等。

图 4 荆银合剂干预COVID-19的KEGG富集分析前20个信号通路 Fig 4 KEGG enrichment analysis of COVID-19 treated with Jingyin mixture in top 20 signal pathways COVID-19: Coronavirus disease 2019; KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes.

一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低发生作用的可能性越大。本研究对荆银合剂中的槲皮素、木樨草素进行分子对接，对接模式见图 5。槲皮素与6LU7、6M3M对接的结合能分别为-2.59、-1.44 kJ/mol，木樨草素与6LU7、6M3M对接的结合能分别为-3.23、-2.56 kJ/mol。结果表明，木樨草素和槲皮素可能通过与SARS-CoV-2的3CL水解酶和SARS-CoV-2核衣壳蛋白结合而产生抗病毒作用。

图 5 荆银合剂主要成分木樨草素和槲皮素与6LU7、6M3M分子对接模式 Fig 5 Molecular docking model of luteolin or quercetin in Jingyin mixture with 6LU7 or 6M3M A: 6LU7 and luteolin; B: 6M3M and luteolin; C: 6LU7 and quercetin; D: 6M3M and quercetin.

在此次疫情防治工作中，中医药显示了独特的优势，荆银合剂也成为上海市抗疫推荐药物^[5]，其可通过提高人体自身免疫力、抵抗外邪入侵实现扶正达邪的作用^[6]。本研究共筛选出荆银合剂入血活性成分120个，潜在作用靶点47个，说明荆银合剂干预COVID-19具有多成分、多靶点的特点。根据主要成分-靶点网络图筛选出的活性成分主要有槲皮素、木樨草素、汉黄芩素、山柰酚、柚皮素、甘草查尔酮A、靛玉红、芒柄花黄素、β-谷甾醇、异鼠李素等，其中槲皮素节点度最大、靶点数目最多。

现代研究表明，槲皮素具有抗病毒、调节自身免疫、抗炎、抗疲劳等作用^[9-12]，其抗病毒机制包括抑制炎症反应^[13-14]、调控细胞周期^[15]、与病毒表面蛋白相互作用等^[16]，此外槲皮素还能够协同抗生素发挥效应^[17]；木樨草素除了具有较强的抗病毒作用^[18]外还具有抗炎作用，其机制可能是通过影响Toll样受体信号通路及凋亡相关因子实现的^[19-20]；汉黄芩素可以通过抑制氧化应激下调活性氧的水平，起到减轻炎症反应的作用^[21]；山柰酚可以抑制病毒mRNA合成和蛋白的表达^[22-23]，选择性地调节MAPK^[24]发挥抗病毒作用；柚皮素可以通过调节机体免疫功能发挥抗炎作用^[25]；甘草查尔酮A有抗炎及保护肝脏的作用^[26-27]。综上所述，荆银合剂的关键化合物都具有抗炎、抗病毒及调节免疫等作用，这为其干预COVID-19提供了理论依据。

荆银合剂的核心靶点主要包括PTGS2、NOS2、PPARG。PTGS2在调节细胞活力、增殖和抵抗细胞凋亡方面发挥重要作用，也是能诱发炎症的炎症因子^[28]。PPARG参与调节血管紧张性，并通过基因转录抑制发挥抗炎、抗氧化等作用^[29]。NOS2的产生受免疫应答影响，介导炎症反应^[30]。

PPI网络结果显示，关键节点主要分为炎症介质和MAPK等，其中以炎症介质数量最多。荆银合剂可能是通过降低IL、TNF等炎症因子的分泌水平、调节巨噬细胞极化、清除自由基等机制发挥抗炎作用^[31-33]。

这些靶点基因GO生物过程富集涉及细胞内脂多糖反应、氧化应激反应、对机械刺激的反应等生物学过程，分子功能主要与细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等有关，主要参与细胞膜与细胞器膜结构的组成。根据KEGG富集分析，荆银合剂主要是通过EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路中EGFR-蛋白激酶C-ERK-Bax路径调控细胞周期，通过NF-κB信号通路中IL-1β-p65-COX2、TNF-α路径发挥抗炎作用，通过HIF-1信号通路中IFNγ-NF-κB-NOS、HMOX1减轻氧化应激损伤。这些过程在荆银合剂干预COVID-19中起到了关键作用。研究表明调节NF-κB通路可抑制甲型流感病毒复制^[34]。HIF-1是一种转录因子，可作为氧稳态的主要调节剂。研究发现，HIF-1通路与病毒性肺炎的炎症因子释放有关^[35-36]。EGFR通路也与炎症抑制、肺损伤减轻有关^[37-38]。为进一步筛选荆银合剂中可能干预COVID-19的潜在活性成分，将荆银合剂中的关键化合物槲皮素、木樨草素与SARS-CoV-2 3CL水解酶、SARS-CoV-2核衣壳蛋白氨基端RNA结合域进行对接，结果显示荆银合剂的活性成分木樨草素和槲皮素与SARS-CoV-2相关蛋白6LU7、6M3M具有一定的亲和力，可能发挥一定的抗病毒作用。

综上所述，荆银合剂干预COVID-19的有效成分可能是槲皮素、木樨草素、汉黄芩素、山柰酚、柚皮素、甘草查尔酮A等，这些成分通过细胞周期、炎症介质等靶点参与HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等通路，从而发挥抗病毒、抗炎、延缓细胞死亡的作用。因此，在荆银合剂的生产和质量控制过程中，应重点关注槲皮素、木樨草素等化学成分。但现阶段研究者们对病毒本身、感染致病机制的认识并不全面，数据库和软件也具有一定局限，故而计算结果可能与临床疗效存在一定的差异性。本研究结果可为中医药干预COVID-19提供理论基础，为临床上用药选择提供依据。

志谢  感谢海军军医大学(第二军医大学)药学系有机化学教研室金永生教授在网络药理学方面给予的技术支持及在活性成分收集上给予的意见与建议。