HBV感染已成为世界性的公共卫生问题，2021年WHO发布的数据显示全球慢性HBV感染者已超过2.96亿人，每年大约有82万人死于HBV感染导致的急慢性肝炎、肝硬化、肝细胞肝癌等疾病^[1]。我国是乙型肝炎大国，2013年国家疾病预防控制局发布的资料显示，2006年我国有近5亿人感染过HBV，有9 300万例乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）携带者^[2-3]，是世界上HBsAg携带人数最多的国家。值得注意的是，临床上存在一种特殊的HBV感染，即感染者血液中HBsAg阴性而肝脏或血液中HBV DNA阳性，通常HBV DNA载量＜200 IU/mL^[4]，此现象称为隐匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）^[5]。OBI患者血清中HBsAg用常规的商业化HBsAg试剂盒难以检出，这对临床HBV感染的预防、筛查、治疗和监测及输血安全性带来了巨大隐患^[6]。OBI的机制尚未阐明，目前病毒基因组中S区基因突变被广泛认为是造成OBI现象的主要原因之一^[7]。OBI患者临床样本中病毒载量低、HBV DNA S区基因片段长，导致PCR成功扩增出目的基因的难度大。探究扩增低载量HBV DNA S区基因的最佳PCR实验条件，对分析造成OBI现象S区基因的突变和氨基酸置换至关重要。本研究探索并自建了一种扩增低载量HBV DNA S区基因的两轮PCR法，并在扩增效率、特异性等方面与传统巢式PCR进行比较，现报告如下。

收集2017年5月至2018年1月经我院检验科筛选获得的28例OBI患者的血清样本（HBsAg检测无反应性，HBV DNA阳性）。HBsAg采用化学发光免疫分析法（Architect i2000SR全自动免疫分析仪，美国雅培公司）定量检测；HBV DNA采用高灵敏HBV DNA检测试剂盒（美国PerkinElmer公司）使用实时定量PCR仪（Lightcycler-480Ⅱ，瑞士罗氏公司）进行检测。高灵敏HBV DNA检测试剂盒的定量检测线性范围为2.0×10~1.0×10⁹ IU/mL，其最低检出限为10 IU/mL。HBV DNA载量＞20 IU/mL即为阳性。本研究通过我院医学伦理委员会审批（2018-IRBQYYS-020），因研究的血清样本为经临床检测后的废弃样本，且不涉及泄漏患者的个人信息问题，故予以免知情同意。

采用核酸磁珠分离提取试剂盒（美国PerkinElmer公司）提取血清DNA，采用微量紫外分光光度计（NanoDrop 1000，美国ThermoFisher Scientific公司）检测核酸浓度和纯度。

从NCBI（National Center for Biotechnology Information）网站（www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/）下载我国人群广泛流行的HBV基因型（B型和C型）序列，采用Primer 5软件设计巢式PCR引物和两轮PCR引物，引物序列见表 1。巢式PCR引物设计了3对（P1~P3），扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因。两轮PCR引物设计了3条正向引物、4条反向引物，共计组合12对引物（P4~P15），扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因。所有引物均由上海华津生物科技有限公司合成。

表 1 (Tab 1)

表 1 巢式PCR和自建两轮PCR的引物序列 Tab 1 Primer sequences for nested PCR and self-built 2-round PCR Primer name Primer sequence (5′-3′) Location Target fragment length/bp Nested PCR   P1 Forward: CACCAAACTCTGCAAGATCCC 16-36 1 075 Reverse: GCCTGCTTAGATTGAATACATGC 1 068-1 090   P2 Forward: CTACTGCCTCTCCCTTATCGTCA 101-123 761 Reverse: CCCATCTCTTTGTTTTGTTAGGG 839-861   P3 Forward: ACATGGAGAACATCACATCAGGA 155-177 654 Reverse: TTGGTAACAGCGGTAAAAAGG 788-808 2-round PCR   P4 Forward: TCATCCTCAGGCCATGCAGT 24-43 802 Reverse: ACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGT 802-825   P5 Forward: TCATCCTCAGGCCATGCAGT 24-43 1 134 Reverse: CGRGCAACGGGGTAAAGG 1 140-1 157   P6 Forward: TCATCCTCAGGCCATGCAGT 24-43 1 172 Reverse: TTGCRTCAGCAAACACTTGG 1 176-1 195   P7 Forward: TCATCCTCAGGCCATGCAGT 24-43 1 258 Reverse: GAGTTCCGCAGTATGGATCGG 1 261-1 281   P8 Forward: CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC 56-85 770 Reverse: ACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGT 802-825   P9 Forward: CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC 56-85 1 102 Reverse: CGRGCAACGGGGTAAAGG 1 140-1 157   P10 Forward: CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC 56-85 1 140 Reverse: TTGCRTCAGCAAACACTTGG 1 176-1 195   P11 Forward: CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC 56-85 1 226 Reverse: GAGTTCCGCAGTATGGATCGG 1 261-1 281   P12 Forward: CCTKCTCGTGTTACAGGCGG 187-206 639 Reverse: ACCCAAAGACAAAAGAAAATTGGT 802-825   P13 Forward: CCTKCTCGTGTTACAGGCGG 187-206 971 Reverse: CGRGCAACGGGGTAAAGG 1 140-1 157   P14 Forward: CCTKCTCGTGTTACAGGCGG 187-206 1 009 Reverse: TTGCRTCAGCAAACACTTGG 1 176-1 195   P15 Forward: CCTKCTCGTGTTACAGGCGG 187-206 1 095 Reverse: GAGTTCCGCAGTATGGATCGG 1 261-1 281 K and R are degenerate bases, where K is G/T and R is A/G. PCR: Polymerase chain reaction.

表 1 巢式PCR和自建两轮PCR的引物序列 Tab 1 Primer sequences for nested PCR and self-built 2-round PCR

第一轮反应：反应体系为20 ng DNA模板、10 μL Taq DNA聚合酶预混合物（TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye，包含dNTP）、2 μL引物P1（本研究中所有引物浓度单位均为pmol/μL），补加DEPC水至20 μL。反应条件为预变性98 ℃ 30 s；变性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 40 s，循环30次。

第二轮反应：第一轮PCR产物1 μL，引物P2 1 μL，其余条件与第一轮反应相同。

第三轮反应：第二轮PCR产物1 μL（1∶10稀释），引物P3 1 μL，退火58 ℃ 30 s，其余条件与第一轮反应相同。

采用PCR扩增仪（Veriti Thermal Cycler梯度PCR仪，美国ABI公司）进行扩增，然后对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将DNA Marker 2000（上海翊圣生物科技有限公司）和PCR产物分别加入各泳道中120 V恒压电泳30 min。待电泳结束后将胶块置于凝胶成像仪（ImageQuant LAS4000，美国GE公司）上观察并记录实验结果。

第一轮反应：反应体系为20 ng DNA模板、25 μL Taq DNA聚合酶预混合物、2 μL引物，补加DEPC水至50 μL。反应条件为预变性98 ℃ 30 s；变性98 ℃ 10 s、退火55 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 65 s，循环30次。

第二轮反应：第一轮PCR扩增产物1 μL（1∶10稀释），引物1 μL，退火62 ℃ 30 s，循环25次，其余条件与第一轮反应相同。

两轮PCR扩增产物的电泳验证过程与上述巢式PCR扩增产物相同。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带凝胶，采用DNA胶回收试剂盒[DiaSpin柱式PCR产物纯化试剂盒，生工生物工程（上海）股份有限公司]进行PCR产物纯化。采用T载体克隆试剂盒（T-Vector pMD^TM 18，大连宝日医生物技术有限公司）对纯化后的PCR产物DNA片段与T载体进行连接，然后将连接物转化至DH5α感受态细胞（苏州新赛美科技生物公司），并涂布至含氨苄青霉素的LB琼脂培养平板上，倒置、过夜培养。次日，挑选平板上单个菌落，每个样本挑取5个单克隆菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，置于37 ℃摇床充分振荡培养。然后将单克隆菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司测序（测序仪型号为ABI3730，美国ABI公司）。利用NCBI网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对PCR扩增产物克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对。

先采用两轮巢式PCR引物（P1、P2）及反应体系，挑选经检测HBV DNA载量低的样本（100~200 IU/mL）和阳性对照（HBV DNA载量＞1×10⁶ IU/mL）验证巢式PCR引物的特异性和反应条件。结果如图 1A所示，阳性对照经扩增出现清晰的目的条带，低病毒载量样本经两轮巢式PCR扩增产物较少，条带亮度较浅，需进行第三轮巢式PCR扩增。

图 1 6例HBV DNA载量较低血清样本的巢式PCR扩增效果 Fig 1 Amplification results of nested PCR in 6 serum samples with low-load HBV DNA A: The agarose gel electrophoresis results for 2 rounds of nested PCR amplification. 1, 2: Low viral load samples; 3: Positive control; 4: Negative control. B: The agarose gel electrophoresis results for 3 rounds of nested PCR amplification. 1-6: Low viral load samples S1-S6. HBV: Hepatitis B virus; PCR: Polymerase chain reaction; M: DL2000 molecular weight marker.

6例低病毒DNA载量样本分别为S1（123 IU/mL）、S2（165 IU/mL）、S3（104 IU/mL）、S4（147 IU/mL）、S5（197 IU/mL）和S6（195 IU/mL），因两轮巢式PCR达不到本研究实验要求，故使用引物P1~P3按照上述三轮巢式PCR条件进行扩增，结果如图 1B所示。在6例样本中仅有2例扩增出清晰的目的条带（S4和S5），另外4例样本均未出现任何特异性条带，扩增结果的重复性较差。应用这3对引物和优化的巢式PCR条件，对22例更低HBV DNA载量（20~99 IU/mL）的血清样本进行扩增，均未能扩增出HBV DNA S区基因。

针对国内主要HBV感染基因亚型的相对保守位点设计12对引物，选择上述巢式PCR重复多次目的条带均光亮且测序结果正确的S4样本（147 IU/mL）作为DNA模板。使用12对引物P4~P15对S4样本进行第一轮PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳（图 2A、2B）显示，引物P4、P5、P6、P7、P8和P9均存在大量的非特异性条带；引物P10和P11第一轮PCR产物条带的位置（＞2 000 bp）均为非特异性扩增；引物P14未出现特异性条带；引物P12、P13和P15（目的基因片段大小分别为639、971和1 095 bp）经第一轮PCR，扩增产物条带分别位于700、1 000和1 100 bp左右，扩增片段与目的基因片段大小相似，但条带亮度较淡。切割引物P12、P13和P15目的片段条带胶回收DNA后进行测序分析，因DNA浓度过低无法正常测序。故使用第一轮PCR产物作为模板，分别再次使用相应的引物进行第二轮PCR扩增。引物P12和P13（目的基因片段大小为639和971 bp）扩增后，扩增产物电泳后出现多个亮度不同的条带，但分别在600、900 bp左右位置出现亮度很强的特异性条带，与目的基因条带位置相近（图 2C、2D）。切割引物P12和P13第二轮PCR扩增产物（图 2C中第1和第2泳道条带）胶回收DNA，进行PCR产物直接测序，测序结果经比对确认为HBV DNA S区基因。使用引物P15经第二轮PCR扩增后未出现任何特异性条带，呈弥散现象。对第一轮PCR扩增产物模板进行最适稀释度的选择，结果显示未稀释与1∶10稀释扩增产生的特异性条带的亮度明显强于1∶100稀释（图 2C、2D）。对PCR总反应体系进行选择发现，50 μL总反应体系扩增产生的条带亮度明显强于20 μL反应体系（图 2D）。

图 2 自建两轮PCR扩增引物的选择和反应条件的优化 Fig 2 Selection of primers and optimization of reaction conditions of self-built 2-round PCR amplification A: The agarose gel electrophoresis results of 1 round of PCR amplification products using primers P4-P10 for S4 samples. Lanes 1-7 are the results using primers P4-P10, respectively. B: The agarose gel electrophoresis results of 1 round of PCR amplification products using primers P11-P15 for S4 samples. Lanes 1-5 are the results using primers P11-P15, respectively. C: The agarose gel electrophoresis results of 2 rounds of PCR with different dilution of templates using primers P12, P13 and P15 for S4 samples. Lanes 1-3 are the results of 2 rounds of PCR amplification using primers P12, P13 and P15, respectively, and product templates from 1 round of PCR without dilution; lanes 4-6 are using primers P12, P13 and P15, respectively, and product templates from 1 round of PCR with 1∶10 dilution. D: The agarose gel electrophoresis results of 2 rounds of PCR with different amplification system using primers P12, P13 and P15 for S4 samples. Lanes 1-3 are the results of 2 rounds of PCR amplification using primers P12, P13 and P15, respectively, and 1∶100 dilution of 1 round of PCR product templates in 50 μL amplification system; lanes 4-6 are the results of 2 rounds of PCR amplification using primers P12, P13 and P15, respectively, and 1∶100 dilution of 1 round of PCR product templates in 20 μL amplification system. PCR: Polymerase chain reaction; M: DL2000 molecular weight marker.

取S1（123 IU/mL）和S2（165 IU/mL）样本，分别使用引物P12、P13和P15进行两轮PCR扩增，进一步验证引物的特异性。两轮PCR扩增的反应体系及条件与上述相同，第二轮PCR扩增中模板为1∶10稀释的第一轮扩增产物。使用引物P15和P12对S1和S2样本的两轮PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳证实均为非特异性扩增，并出现较多的引物二聚体（图 3）。使用引物P13（目的基因片段大小为971 bp）进行两轮PCR扩增，电泳所示约在1 000 bp的位置出现目的条带（图 3），切割引物P13扩增产物（第3泳道和第6泳道）胶回收后进行DNA测序，因样本核酸浓度过低导致测序失败。进一步将第3和第6泳道条带胶回收后，将DNA与T载体连接，连接物转化至感受态细胞并挑选单克隆菌落进行克隆测序，测序结果经BLAST比对证实为HBV DNA S区基因。引物P13对3例低病毒载量样本（S1、S2、S4样本）的扩增均有较好的特异性，因此选择P13作为最优引物进行后续血清样本HBV DNA S区基因扩增。

图 3 选择引物P12、P13和P15的自建两轮PCR扩增结果 Fig 3 Amplification results of self-built 2-round PCR using primers P12, P13 and P15 Lanes 1-3 are the agarose gel electrophoresis results of 2 rounds of PCR using primers P15, P12 and P13 for S1 samples, respectively; lanes 4-6 are the agarose gel electrophoresis results of 2 rounds of PCR using primers P15, P12 and P13 for S2 samples, respectively. The boxes are the gel cut area for recovery. PCR: Polymerase chain reaction; M: DL2000 molecular weight marker.

确定两轮PCR使用P13引物及50 μL总反应体系后，随机挑选5例更低HBV DNA载量的OBI血清样本A1（22.8 IU/mL）、A2（36.7 IU/mL）、A3（53.5 IU/mL）、A4（30.5 IU/mL）和A5（28.6 IU/mL）进行进一步的验证。结果如图 4所示，在约1 000 bp的位置均出现目的特异性条带（目的基因片段大小为971 bp），但条带亮度较弱，故切割条带胶回收PCR扩增产物，进行PCR产物克隆测序。测序结果经BLAST比对均为HBV DNA S区基因。

图 4 5例更低HBV DNA载量血清样本的自建两轮PCR扩增HBV DNA S基因的验证结果 Fig 4 Validation results of self-built 2-round PCR amplification for HBV DNA S-gene from 5 serum samples with lower-load HBV DNA Lanes 1-5 are the agarose gel electrophoresis results of PCR products for samples A1-A5, respectively. HBV: Hepatitis B virus; PCR: Polymerase chain reaction; M: DL2000 molecular weight marker.

采用自建两轮PCR法对28例OBI血清样本HBV DNA S区基因进行扩增，其中6例低HBV DNA载量的样本均成功扩增出特异性靶序列，扩增产物经克隆测序确认为HBV DNA S区基因。22例更低HBV DNA载量的血清样本中有15例（68.18%）成功扩增出HBV DNA S区基因，且扩增出的目的基因条带清晰可见，经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因。15例获得成功扩增HBV DNA S区基因的样本中有8例HBV DNA载量＜30 IU/mL，最低为20.1 IU/mL。

目前我国仍是HBV高感染国家，在实验诊断工作中经常会遇到少见的HBV血清学表现模式，如HBsAg和乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）同时存在、HBsAg阴性但乙型肝炎e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）阳性、HBsAg阴性但HBV DNA阳性、仅乙型肝炎核心抗体强阳性等，甚至不同的诊断试剂检测HBsAg结果不一致。这些血清学诊断的少见模式往往与HBV DNA S区基因突变，尤其是“a”决定簇内点突变有关^[8]。HBsAg阴性而HBV DNA阳性此种OBI现象的存在对HBV感染血清学诊断指标的检测带来极大挑战，也对临床慢性乙型肝炎的预防和筛查、治疗及输血安全性等带来巨大隐患^[6]。探究和分析造成OBI的原因是提高我国HBV感染血清学诊断试剂质量的重要环节，而HBV DNA S区基因测序是必备的研究手段。

由于OBI血清中HBV DNA载量很低，HBV DNA S区基因片段的大小可达680 bp，采用常规PCR技术很难扩增出能供进一步研究分析的S区全长基因片段。对从近万份血清样本中筛选获得的28份OBI血清样本进行HBV DNA S区基因测序分析，必须从血清样本中扩增出S区全长基因片段。本研究决定采用文献中广泛报道的巢式PCR法，这是目前OBI临床样本HBV DNA S区基因扩增的主流方法。综合文献和我国广泛流行的HBV基因型B型和C型序列，本研究设计了3对引物P1~P3用于巢式PCR，并对模板最适浓度、PCR总反应体系、引物总量、退火温度等实验条件进行优化。然而，6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列，22例更低HBV DNA载量的血清样本也无一例扩增成功。分析认为巢式PCR失败的原因主要存在以下几个方面：（1）因荧光定量PCR检测试剂盒的核酸提取工艺、引物设计存在差异，导致对HBV DNA载量的检测下限有所不同。本研究中采用高灵敏HBV DNA检测试剂盒，检测下限可至10 IU/mL，灵敏度较高。因此，本研究获得的大部分OBI血清样本HBV DNA载量＜50 IU/mL，相较大部分文献中OBI样本病毒载量更低，从而导致常规巢式PCR扩增失败。（2）在设计巢式PCR引物时未能很好地考虑HBV基因的多种亚型，本研究中引物的设计主要针对B型和C型序列。（3）采用20 μL PCR反应体系造成目的基因产物偏少。考虑到三轮巢式PCR需多次PCR扩增，还会对测序分析的真实性带来影响，故放弃。

针对以上研究出现的问题，本研究选择国内主要HBV基因亚型相对保守的位点重新设计引物，3条正向引物、4条反向引物，共组合成12对，包含K、R 2个简并碱基。考虑到OBI血清中HBV DNA浓度低，一轮PCR很难扩增出可满足测序或连接克隆载体的靶DNA片段所需的量。因此，将一轮PCR产物作为模板，使用相同的引物再次进行PCR扩增，以增加产物含量。将临床样本S4样本（HBV DNA载量147 IU/mL）DNA作为模板筛选这12对引物扩增的有效性，经过一轮PCR只有引物P12、P13和P15扩增出目的基因，但因目的基因扩增产物较少，无法满足测序和连接载体的要求。使用P12、P13和P15分别对各自一轮PCR扩增的产物再次扩增，两轮PCR扩增后，仅P13扩增出较为明显的特异性条带。继而，以P13为引物，对一轮PCR产物模板浓度、引物的量、退火温度、PCR反应体系等进行了优化，从而确定最佳实验条件。以最佳实验条件对22例更低HBV DNA载量样本和6例低载量的样本进行HBV DNA S区基因扩增，6例低载量的样本全部成功，22例更低HBV DNA载量样本中15例扩增出HBV DNA S区基因，其中最低HBV DNA载量仅20.1 IU/mL，且所有PCR产物均经过测序确认。为了分析7例更低HBV DNA载量血清样本未获得成功扩增的原因，对原始7例样本核酸模板采用高灵敏HBV DNA检测试剂盒进行复检，发现7例复测后均为阴性。我们认为，这或许与前期实验中提取的核酸模板未进行分管保存，在后续实验中存在反复冻融现象引起裸露的DNA分子降解有关，也可能是假阳性。

综上所述，本实验自建的两轮PCR法更适用于低HBV DNA载量样本中HBV DNA S区基因的扩增，引物设计简便、有效，扩增效率和特异性均优于传统的巢式PCR。该方法为进一步研究OBI患者HBV DNA S区基因突变、正确解释HBsAg检测失败现象、深入探究HBsAg突变株与OBI的相关性奠定了良好的方法学基础。同时，多轮PCR方法的思路也可扩展于其他目的DNA低载量时的PCR扩增，为科学研发灵敏度高、特异性高的核酸检测试剂提供了理论依据。