2021, Vol. 42
2. 海军军医大学(第二军医大学)东方肝胆外科医院国际合作生物信号转导研究室, 上海 200438;
3. 复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所, 上海 200032
2. International Cooperation Laboratory on Signal Transduction, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200438, China;
3. Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Shanghai 200032, China
马兜铃酸（aristolochic acid）是一类植物次生代谢产物，广泛存在于马兜铃科植物中，在马兜铃属中常见，细辛属中也可检出[1]。马兜铃科植物共有500多种，在亚洲地区被作为传统药物用于治疗多种疾病[2]。中国地区的马兜铃科植物主要有4属共70余种，其中大多数是药用植物，例如马兜铃、细辛、青木香、广防己、关木通、天仙藤等[3]，常作为中药材配伍使用，具有止咳平喘、祛风止痛和清热活血等功效。马兜铃酸为一类硝基菲类羧酸，已知的马兜铃酸类化合物主要有4种，分别为马兜铃酸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其结构差异主要是甲氧基或羟基的位置不同，其中马兜铃酸Ⅰ（C17H11NO7）为主要毒性成分[4]。
马兜铃酸的肾毒性已成为共识，早在20世纪60年代就有将食用含马兜铃酸植物与肾脏毒性相关联的报道[5]。泌尿系统致癌性的发现使马兜铃酸被列为Ⅰ类致癌物，多个国家和地区开始禁售禁用含马兜铃酸类药物[6]，我国也对其使用进行了严格控制和监管[7-8]。2017年，Sci Transl Med刊载的一项研究认为马兜铃酸与中国台湾及亚洲其他地区的肝癌发生密切相关[9]，而此前的临床病例研究和动物实验鲜有马兜铃酸致肝癌的报道[10-13]，因此，该研究结果引起了广泛关注。随后，研究人员开展了多项马兜铃酸与肝癌发生的关联性研究，国内多个团队也针对马兜铃酸是否为我国肝癌的致病因素展开了探讨。本文从马兜铃酸的肾毒性和致癌性入手，重点讨论马兜铃酸与肝癌相关的争论点及含马兜铃酸药物研究中尚待解决的问题，并对中药安全使用展开思考。
1 马兜铃酸的肾毒性和致癌性 1.1 马兜铃酸的肾毒性20世纪20年代，在多瑙河流域出现了一种聚集性间质性肾病，称为巴尔干半岛地方性肾病（Balkan endemic nephropathy，BEN）或多瑙河地区性家族性肾病（Danubian endemic familial nephropathy，DEFN）。该病具体病因不明，直到1957年，巴尔干地区的兽医发现马在食用含有马兜铃的草料后出现了进行性肾功能衰竭，且症状与人类十分相似，自此将马兜铃科植物与慢性肾功能衰竭关联起来。1969年，克罗地亚微生物学家发现巴尔干地区的肾病可能与马兜铃酸中毒密切相关[5]。20世纪90年代初，Vanherweghem等[14]发现2例比利时女性患者在服用含马兜铃科植物广防己的草药减肥丸后出现以肾间质纤维化为主的进行性肾损害，次年又发现7例相似的患者，该研究发表在Lancet上，很快引起了全世界对于马兜铃酸相关肾病的密切关注。我国早在20世纪60年代就有学者报道大剂量使用马兜铃科植物关木通可导致急性肾功能衰竭[15]；20世纪90年代末，黎磊石院士团队再次报道关木通可导致肾功能损伤[16]；此外，国外还报道了多起因大量服用龙胆泻肝丸（含关木通）而出现肾功能损伤的病例[17-18]。
1.2 马兜铃酸的致癌性马兜铃酸与泌尿系统和胃部肿瘤的发生密切相关[10-13]。具有强亲电能力的马兜铃酸内酰胺氮离子能与DNA碱基环外氨基亲电结合，生成相应的脱氧腺苷加合物和脱氧鸟苷加合物[17-18]，进而诱导基因产物A-T颠换突变，形成与马兜铃酸致癌和致突变活性相关的生物标志物，在国际基因组数据库中这一特征性突变被称为马兜铃酸突变标签[19]。A-T颠换突变标签在马兜铃酸导致的尿路上皮癌和膀胱癌中均有报道[20-22]。大量动物实验也表明，泌尿系统与胃部是小鼠和大鼠暴露于马兜铃酸后最常观察到肿瘤的部位[23-25]。
2 马兜铃酸与肝癌的关系 2.1 马兜铃酸肝脏致癌性的报道2017年，Sci Transl Med刊发了Ng等[9]的研究成果，指出马兜铃酸与中国台湾及亚洲其他地区肝癌的发生相关。该研究通过全外显子测序分析发现，我国台湾地区98例肝癌患者样本中有78%存在马兜铃酸特征性A＞T:T＞A突变，而在我国内地的89例肝癌患者样本中有47%存在马兜铃酸相关特征性突变，该结论一经报道即引起我国医学界的高度关注。2018年，Int J Camcer刊发了一项基于我国台湾地区全民医疗数据库的流行病学研究，指出马兜铃酸暴露可能是台湾地区HBV相关肝癌发生的重要风险因素[26]。同时，在丙型肝炎病毒阳性感染的患者中，马兜铃酸也会增加其罹患原发性肝癌的风险[27]。2019年，上海交通大学团队研究发现，2周龄小鼠腹腔注射马兜铃酸Ⅰ可在小鼠9个月龄时诱发肝癌，并且可在小鼠肝脏组织中检出马兜铃酸-DNA加合物；对小鼠肝癌进行基因组测序发现肿瘤中存在典型的A＞T颠换，并导致H-ras等癌基因突变；该研究同时检测了62例肝细胞癌样本，发现其中16例（25.8%）存在马兜铃酸-DNA加合物[28]。同年，复旦大学附属中山医院樊嘉院士团队的研究表明，在159例HBV相关肝细胞癌患者中，总体突变图谱显示A＞T突变比例并无显著优势，其中约1/3的样本可检出突变标签22（signature 22），但值得注意的是，突变标签22并非都为该研究样本的主要突变类型[29]。此外，一项基于细胞实验的研究报道了马兜铃酸Ⅰ可通过介导上皮间质转化促进肝癌细胞的侵袭、转移[30]。
2.2 马兜铃酸肝脏致癌性存在争议马兜铃酸及其衍生物与亚洲地区肝癌发生广泛相关的研究结果[9]一经报道就引起了广泛的争论，马兜铃酸是否具有直接的肝脏致癌性、是否为中国肝癌患者的致癌原因之一至今仍未有定论。
2.2.1 目前尚无中国内地发布的马兜铃酸导致肝癌的大型队列流行病学证据马兜铃酸相关化合物在中草药中分布广泛，且在不同生药和方剂中含量差异较大，目前难以实现对其明确定量。同时，我国医疗记录电子化在近年来才逐步实现，对于2004年起我国逐步限制使用马兜铃酸药材之前的用药史较难追溯。上述原因导致大规模的马兜铃酸暴露与肝癌相关性的临床流行病学调查难度很大。此外，临床上鲜有确诊为马兜铃酸肾病或马兜铃酸所致泌尿系统肿瘤患者并发原发性肝癌的病例报道，也不支持含马兜铃酸中药是中国大陆肝癌患者致癌原因的推断。
2.2.2 临床样本中马兜铃酸暴露与肝癌发生直接关联的证据不足（1）目前关于马兜铃酸肝脏致癌性的相关报道主要为基因组数据分析，受病例背景、数据质量及分析方法影响较大。2017年Ng等[9]的研究主要应用自行开发的算法mSigAct（mutational signature activity，突变标签活性）分析了98例中国台湾地区及多个数据库中亚洲其他地区肝癌患者的基因组数据，得到马兜铃酸与中国台湾及亚洲其他地区肝癌发生广泛相关的结论。但该研究样本量有限，且使用了大量公共数据库中的资源，数据质量参差不齐。有研究者采用其他算法重新分析该研究中肝癌样本数据，只发现5个（5.7%）具有马兜铃酸相关特征突变的样本，认为mSigAct算法会将A＞T颠换突变较多但占总突变比例不高的样本判定为马兜铃酸特征突变，导致阳性率偏高；他们还分析了肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中187例亚洲肝癌患者的基因组数据，其中马兜铃酸标签检测阳性的病例仅有19例[31]。
（2）定义马兜铃酸阳性暴露的方法存疑。目前大部分研究将A＞T:T＞A突变或基因标签22作为马兜铃酸的特征性突变，然而，任何可以加合到DNA腺嘌呤上并导致A＞T颠换突变的致癌物都会形成该突变特征，如氯乙烯导致的肝血管肉瘤和肝细胞癌样本中也可检测到A＞T颠换突变[32]。马兜铃酸-DNA加合物为马兜铃酸暴露更加直观的检测指标，但由于高纯度的标准品较难获得、检测的精确度有待提高等问题，尚未实现在大样本病例中的检测。
（3）针对中国肝癌患者样本的研究无法排除HBV感染这一重要病因对基因突变的干扰。2019年在第22届全国临床肿瘤学大会上公布的中国原发性肝癌临床登记调查中期报告显示，中国肝癌的主要病因仍为HBV慢性感染，占比高达92.05%。因此研究中国地区肝癌发生的高危因素时，必须考虑慢性乙型肝炎这一高权重影响因素，以准确反映不同国家和地区肝癌的病因学特点。
2.2.3 动物实验中支持马兜铃酸对肝脏具有直接致癌性的证据有限大量既往研究表明，马兜铃酸小剂量长期灌胃主要导致小鼠前胃肿瘤，大剂量给药则以诱导肾功能衰竭或泌尿系统肿瘤为主，并未发现肝脏是马兜铃酸致癌的主要靶器官，表明马兜铃酸系统性给药导致的毒性可能具有一定的器官特异性[10-13]。2019年上海交通大学团队的研究使用2周龄小鼠建立腹腔注射马兜铃酸动物模型，发现小鼠9个月龄后可观察到肝脏肿瘤的形成[28]。但需要注意的是，该模型中2周龄小鼠处于肝脏细胞快速增殖期，DNA的快速复制利于突变的形成；且小鼠出生7~15 d具有解毒功能的肝脏酶系活性尚未达到成体水平，对致癌物具有高易感性[33]。另有研究比较了不同性别和年龄小鼠肝脏代谢谱的差异，表明2周龄和8周龄小鼠肝脏Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶存在显著差异，内源性代谢物质含量也不同[34]。因此，在幼鼠模型中评估马兜铃酸的致癌性具有一定偏倚，其在成年鼠中是否具有致肝癌作用仍有待证实。此外，在无HBV感染的动物模型中评估马兜铃酸系统性给药的致肝癌风险无法模拟人群中的真实情况。
本研究团队针对以上争论点已展开大样本的人群流行病学调查和多中心肝癌样本全基因组突变分析，期望确定中国大陆肝癌患者中A＞T:T＞A突变比例及其与HBV感染的相关性。本研究团队与中国科学院上海药物研究所团队合作，正对检测组织中马兜铃酸Ⅰ-DNA加合物的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）方法进行改进，以用于人组织样本中马兜铃酸Ⅰ-DNA加合物的痕量检测[35]，将用于评价临床患者组织中马兜铃酸Ⅰ-DNA加合物的水平。同时，我们也已开展马兜铃酸长期系统性给药动物实验，在正常基因型和HBV转基因成年及幼年小鼠中观察小剂量马兜铃酸长期暴露对肝脏的毒性和成瘤作用，并全面考察其对各脏器的影响。这些结果将为马兜铃酸是否可直接导致肝细胞癌提供证据。
3 含马兜铃酸药物研究中尚待解决的问题2002年，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将马兜铃酸列为Ⅰ类致癌物。英国、加拿大、德国、澳大利亚等国陆续禁止了含马兜铃酸草药的进口和使用[6]。我国政府相关部门和医药界也非常关注马兜铃酸的毒性作用，台湾和香港分别于2003年和2004年禁止了含马兜铃酸类药物的使用[7]，内地也于2004年开始逐步取消含马兜铃酸药物的使用[8]，并对仍记录在《中华人民共和国药典》中的药物进行了马兜铃酸含量限制。但因临床需求，仍有一些含马兜铃酸的药材允许配伍使用。2017年10月30日，国家食品药品监督管理总局发布了含马兜铃属药材且已上市中成药品种名单，其中共有47种中成药，可能含有马兜铃酸的马兜铃科药材中仍有24种在配伍使用[36]。含马兜铃酸中草药的安全使用还需解决以下几个问题。
3.1 马兜铃酸毒性预警标志物的鉴定已有研究表明服用含马兜铃酸的药物后可在肾脏组织中检测到马兜铃酸-DNA加合物，且加合物可以稳定存在数年[18]。目前，马兜铃酸-DNA加合物可以通过LC-MS/MS、液相色谱-电喷雾质谱（liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry，LC-ESI-MS）、超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）、32P后标记和HPLC荧光等方法进行检测[37-38]，可以在109数量级的核苷酸中检测出马兜铃酸-DNA加合物[39]。然而，目前的研究并没有明确的马兜铃酸毒性阈值，无法通过马兜铃酸-DNA加合物定量预警潜在的器官毒性或成瘤风险。虽然大量动物实验证实了马兜铃酸-DNA加合物与马兜铃酸的暴露具有一定的量效关系，但由于人体马兜铃酸的摄入量难以量化，在人的肾脏或其他组织样本中尚未建立这种正相关的量效关系。同时，正常情况下，人体肝脏中马兜铃酸-DNA加合物含量极低，对检测方法灵敏度要求较高，也容易出现假阳性结果。此外，肝脏代谢酶系的个体差异也会使定量马兜铃酸-DNA加合物的毒性阈值更加困难。因此，更加系统地研究马兜铃酸的代谢过程和致毒机制、鉴定其毒性标志物、明确其毒性阈值是实现马兜铃酸毒性作用早期预警的关键。
3.2 含马兜铃酸药材的安全剂量问题马兜铃酸类似物包括20多种化合物，广泛地分布在马兜铃属和细辛属植物[40]中。不同的马兜铃科植物所含马兜铃酸类似物的种类及含量均不同[41]。有研究对北马兜铃的外果皮、内果皮、隔膜和种子等进行分析，鉴定出10种马兜铃酸类似物，并且不同部位含有的马兜铃酸类似物成分也存在较大差异[42]。目前尚有几十种含马兜铃属药材的中成药在市场销售，已有对含马兜铃属药材的复方制剂进行马兜铃酸类似物检测的研究，但是目前的研究大多数只局限在对马兜铃酸Ⅰ的限量检测[43-44]，对其他众多衍生物类化合物尚缺乏有效的系统风险评估。因此，开展含马兜铃酸中药材及其相关中成药中马兜铃酸及马兜铃酸内酰胺类成分的含量测定十分必要。
3.3 马兜铃酸联合减毒药物的开发由于含马兜铃酸药材在药物中配伍使用的需求，其减毒药物的开发也已展开。将含马兜铃酸的中药与某些单味中药或复方药剂配伍使用可达到减毒的效果，例如，黄芪[45]、牡丹皮[46]、生地黄[47]、竹叶[48]、黄连[49]等单味中药与含马兜铃酸的药材共煎可以显著降低马兜铃酸的溶出率；冬虫夏草、丹参等中药则可减轻马兜铃酸引起的肾小管损伤，抑制肾小管纤维化[50-52]；炮附子联合干姜与关木通配伍使用时药物中马兜铃酸Ⅰ水平显著降低，同时可减轻大鼠急性肾功能损伤[53]；传统复方导赤散配伍使用后也可降低关木通煎液中马兜铃酸Ⅰ的溶出量[54]。另有研究通过加强马兜铃酸主要代谢酶的解毒作用以减轻其毒性[55]。例如，在小鼠体内诱导P4501A1/2表达后，马兜铃酸Ⅰ的清除率显著提高；且P4501A1/2诱导剂预处理可保护小鼠免于马兜铃酸Ⅰ引起的肾功能衰竭[13]。双香豆素预处理可抑制小鼠肾脏醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1）活性，减轻马兜铃酸Ⅰ引起的小鼠肾损伤，提高存活率[12]。然而，以上研究均从单一药物的减毒作用展开，筛选效率较低，且实验体系各不相同，较难进行数据的有效整合利用。在今后的研究中如何借助高通量的药物筛选平台进行减毒药物的高效快速筛选，并通过标准化流程确立最合适的药物配伍是值得关注的一个方向。同时，药物重定向，尝试老药新用，扩大已知药物的适应证也是减毒药物开发的一个新思路[56]。
4 关于中药安全使用的思考我国是中药消费大国，近年来随着我国中医药发展战略的实施，中医药发展迎来了新的历史机遇，一大批源自中医药的研究成果在世界范围内获得广泛认可。但同时近年来中药不良反应/事件频频发生，增加了部分民众对中药安全性的疑虑和担忧。目前中药标准化安全性研究还相对滞后，服用中药患者的健康档案等基础性工作也不够完善，严重影响了中医药事业的健康可持续发展。将中药使用纳入电子档案，做到药物使用可追溯，是保障中药安全使用的重要一步。随着生物学技术的进步和大数据时代的到来，利用组学技术、大数据信息对传统中药、道地药材和中药复方进行组分确定，可进一步完善质量控制与药效评价体系；将先进的制药技术用于中药制剂，可进一步加强药物天然活性成分的鉴定和分离；同时，建立和完善现代中药制剂的研究平台，培养相关人才和团队，展开作用机制研究，揭示方剂功效成分与其生物效应相关性，才能保障中药安全有效的使用，服务大众健康，并加快国际化的进程。
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