第二军医大学学报  2020, Vol. 41 Issue (7): 780-786   PDF    
引用本文
孙伟, 白宗科, 姜梨华, 邵晓轶. 微RNA-200家族对程序性死亡配体1的调控及其在非小细胞肺癌中的临床意义[J]. 第二军医大学学报, 2020, 41(7): 780-786  
SUN Wei, BAI Zong-ke, JIANG Li-hua, SHAO Xiao-yi. Regulation of programmed death ligand 1 by microRNA-200 family and its clinical significance in non-small cell lung cancer[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2020, 41(7): 780-786 (in Chinese with English abstract)  
微RNA-200家族对程序性死亡配体1的调控及其在非小细胞肺癌中的临床意义
孙伟1, 白宗科2, 姜梨华3, 邵晓轶1     
1. 南通大学医学院免疫学系, 南通 226000;
2. 中国药科大学生命科学与技术学院, 南京 211198;
3. 海军军医大学(第二军医大学)东方肝胆外科医院仪器设备科, 上海 201805
收稿日期: 2020-05-12    接受日期: 2020-06-22
基金项目: 国家自然科学基金(81771767，81801580).
作者简介: 孙伟, 硕士生.E-mail:13331998355@189.cn.
通信作者(Corresponding author): 邵晓轶, Tel:0513-85051735, E-mail:xy_shao@163.com.
摘要: 目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)免疫检查点分子程序性死亡配体1(PD-L1)的表达及其与miRNA-200家族之间的调控关系，阐明PD-L1在NSCLC中的临床意义及调控机制。方法 选取138例NSCLC患者癌组织及配对的癌旁组织标本，采用免疫组织化学染色检测PD-L1表达，qRT-PCR检测miRNA-200家族(miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429、miRNA-141)的表达水平。培养肺癌A549细胞，通过转染miRNA-200家族5个miRNA模拟物使其过表达，采用蛋白质印迹法检测miRNA-200家族过表达对PD-L1表达的影响，CCK-8实验检测miRNA-200家族过表达对A549细胞增殖活性的影响，荧光素酶报告基因实验验证miRNA-200家族对PD-L1的调控作用。结果 138例NSCLC患者癌组织PD-L1总阳性率为58.7%(81/138)，高于癌旁组织(3.6%，5/138)，差异有统计学意义(P < 0.05)；PD-L1表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型无关，而与淋巴结转移、脉管侵犯、临床TNM分期有关(P均 < 0.05)。NSCLC癌组织中miRNA-200家族表达水平均低于癌旁组织(P均 < 0.01)，且PD-L1表达阳性的患者具有更低水平的miRNA-200家族表达水平(P均 < 0.01)。A549细胞过表达miRNA-200家族能下调PD-L1的表达(P均 < 0.01)，且抑制癌细胞增殖活性(P均 < 0.01)。荧光素酶报告基因实验证实miRNA-200家族直接负调控PD-L1的表达(P均 < 0.01)。结论 PD-L1高表达预示NSCLC患者预后不良。PD-L1是miRNA-200家族的靶基因，miRNA-200家族表达水平低可能是NSCLC患者高表达PD-L1的重要原因。
关键词: 非小细胞肺癌    微RNA-200家族    程序性死亡配体1    分子调控机制    免疫治疗    
Regulation of programmed death ligand 1 by microRNA-200 family and its clinical significance in non-small cell lung cancer
SUN Wei1, BAI Zong-ke2, JIANG Li-hua3, SHAO Xiao-yi1     
1. Department of Immunology, School of Medicine, Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu, China;
2. School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, Jiangsu, China;
3. Department of Medical Equipment, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 201805, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (81771767, 81801580).
Abstract: Objective To investigate the expression of the immune checkpoint molecule programmed death ligand 1 (PD-L1) in non-small cell lung cancer (NSCLC) and its regulatory relationship with the microRNA-200 (miRNA-200) family, and to elucidate the clinical significance and regulatory mechanism of PD-L1 in NSCLC. Methods NSCLC cancer tissues and matched paracancerous tissues (138 cases) were selected for this study. The PD-L1 expression was detected by immunohistochemistry and the expression levels of miRNA-200 family (miRNA-200a, miRNA-200b, miRNA-200c, miRNA-429, and miRNA-141) were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Lung cancer A549 cells were cultured and transfected with five miRNA mimics of miRNA-200 family. The effect of miRNA-200 family mimics on PD-L1 expression and proliferation activity of A549 cells were detected by Western blotting and cell counting kit-8 (CCK-8) assay, respectively. Luciferase reporter gene assay was used to elucidate the regulation of PD-L1 by miRNA-200 family. Results Total positive rate of PD-L1 in 138 NSCLC tissues was 58.7% (81/138), which was significantly higher than that in paracancerous tissues (3.6%, 5/138) (P < 0.05). The expression level of PD-L1 was not related to the patients' gender, age, tumor size or histological types, but was closely related to lymph node metastasis, vascular invasion and clinical TNM stage (all P < 0.05). The miRNA-200 family was expressed at a low level in NSCLC tissues than that in paracancerous tissues (all P < 0.01), and patients with positive PD-L1 expression had significantly lower levels of miRNA-200 family expression (all P < 0.01). Overexpression of miRNA-200 family in A549 cells significantly down-regulated PD-L1 and inhibited proliferation activity of cancer cells (all P < 0.01). Luciferase reporter gene assay confirmed that the miRNA-200 family directly and negatively regulated the expression of PD-L1 (all P < 0.01). Conclusion High expression of PD-L1 in NSCLC indicates poor prognosis. PD-L1 is the target gene of miRNA-200 family, and the low expression of miRNA-200 family may be an important reason for the high expression of PD-L1 in NSCLC.
Key words: non-small cell lung cancer    microRNA-200 family    programmed death ligand 1    molecular regulatory mechanism    immunotherapy    

肺癌是全球范围内发生率与死亡率最高的恶性肿瘤之一，美国最新统计报告显示，预计2020年全美新发癌症患者达1 806 590例，死亡606 520例，其中新发支气管癌及肺癌228 820例，死亡135 720例[1]。支气管癌及肺癌中80%以上是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，由于发病隐匿，多数NSCLC患者确诊时已处于晚期，失去手术机会，预后较差[2]。免疫抑制信号的激活是癌细胞免疫逃避的重要机制，近几年针对免疫检查点分子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、程序性死亡蛋白1(programmed death 1，PD-1)、程序性死亡配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)设计的抗肿瘤免疫治疗发展迅猛，CTLA-4、PD-1、PD-L1抑制剂在临床前和临床试验中获得良好疗效[3]。虽然这些免疫抑制剂显著延长了部分肺癌患者的生存期，但总体反应率仍然很低[4]。为了提高肺癌免疫治疗疗效，有必要深入研究肺癌免疫检查点分子表达和功能的调控机制，挖掘其中调控信号通路的生物标志物，并通过这些生物标志物筛选可能的免疫治疗获益病例，这正是当前急需解决的问题。本研究拟探讨NSCLC癌组织中PD-L1的表达及调控机制，阐明PD-L1与miRNA-200家族的关系，为临床设计更优越的以PD-L1抗体为主导的协同治疗方案提供依据。

1 材料和方法 1.1 病例标本

收集南通大学附属医院2018年1月至2019年12月138例NSCLC患者资料和标本，所有患者术前均未接受任何方式针对肿瘤的治疗。138例患者中，男97例，女41例；年龄37~86岁，中位年龄68岁。所有患者均经病理组织学检查确诊，其诊断、分型及分期依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)标准[5]。手术标本取癌组织和相应的癌旁组织，癌组织避开中心坏死区取材，癌旁组织在距癌组织边缘2 cm以外的区域取材。一部分标本经甲醛固定、石蜡包埋后切片，用于免疫组织化学染色；一部分新鲜标本于－80 ℃保存，用于qRT-PCR检测。本研究通过南通大学附属医院生物医学研究伦理委员会审批。

1.2 临床标本PD-L1免疫组织化学检测

免疫组织化学染色过程参照SP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)说明进行。鼠抗人PD-L1单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司，工作浓度为1:100。每张切片在200倍镜下计数5个视野的阳性细胞数，并计算阳性率。

1.3 临床标本miRNA-200家族qRT-PCR检测

将新鲜NSCLC标本经TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)裂解提取总RNA，采用qRT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)检测miRNA-200家族5个成员(miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429、miRNA-141)的含量。内参选用U6基因。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 肺癌细胞系A549过表达miRNA-200家族实验

人肺癌A549细胞系由中国科学院上海生物细胞研究所提供，用含10% FBS的DMEM培养液(美国Gibco公司)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。设计miRNA-200家族模拟物(mimics)，并设置阴性对照(miRNA-NC)，均由广州锐博生物技术有限公司化学合成。将A549细胞按每孔1×106个细胞的密度接种于6孔板中，培养过夜后细胞贴壁，换无血清培养液并加入miRNA-200家族模拟物(终浓度20 µg/mL)，继续培养48 h。收集细胞，采用TRIzol试剂盒提取总RNA，采用qRT-PCR检测miRNA-200家族的表达水平。

1.5 肺癌细胞系A549表达PD-L1的蛋白质印迹检测

A549细胞转染miRNA-200家族模拟物后培养48 h，收集细胞，采用TRIzol试剂盒抽提总蛋白，用蛋白质印迹法检测PD-L1的表达。以GAPDH作为内参照。PD-L1抗体(货号ab213524，工作浓度1:1 000)和GAPDH抗体(货号ab181602，工作浓度1:2 000)均为英国Abcam公司产品。

1.6 miRNA-200家族对A549细胞增殖活性的影响

将A549细胞按每孔5×103的密度接种于96孔板中，培养过夜后细胞贴壁，换无血清培养液并加入miRNA-200家族模拟物(终浓度为20 µg/mL)，继续培养24、48、72 h；弃培养液，每孔加入100 μL 0.1 mol/L PBS，再按CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)说明书加入CCK-8试剂，置孵箱内孵育过夜。用酶标仪(Bio-Rad公司)进行检测，读取570 nm波长处光密度值，校正波长为655 nm。计算细胞存活率：细胞存活率(%)＝[(实验孔光密度值－空白孔光密度值)/(对照孔光密度值－空白孔光密度值)]×100%。

1.7 PD-L1与miRNA-200家族调控的荧光素酶报告基因验证

合成PD-L1基因的3'-非翻译区(untranslated region，UTR)序列的2个片段F1和F2，F1(5'-AGAGTCTCAGTGTTG-3')含有miRNA-200a和miRNA-141的结合位点，F2(5'-AACGGGACAGTATTT-3')含有miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-429的结合位点。将F1和F2分别插入荧光素酶报告基因载体(pGL3-Control，美国Promega公司)中，构建pGL3-F1和pGL3-F2质粒。将A549细胞按每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板，培养24 h后换无血清培养液，加入miRNA-200家族模拟物和阴性对照miRNA-NC(终浓度20 µg/mL)，24 h后每孔加入pGL3-F1和pGL3-F2各200 ng进行转染，并加入pRL-TK质粒(美国Promega公司)20 ng进行共转染，再培养48 h后，回收并裂解细胞，测定荧光素酶活性。

1.8 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ2检验。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 NSCLC癌组织PD-L1表达与临床病理学特征的关系

免疫组织化学染色结果显示，PD-L1阳性反应多见于细胞核和细胞质(图 1)，NSCLC癌组织PD-L1阳性率为58.7%(81/138)，而癌旁组织阳性率仅为3.6%(5/138)，癌组织PD-L1阳性率高于癌旁组织(P＜0.05)。分析PD-L1与NSCLC临床病理特征的关系，结果显示，PD-L1表达水平与NSCLC患者的性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型无关，而与淋巴结转移、脉管侵犯、临床TNM分期密切相关，有淋巴结转移、有微血管和淋巴管侵犯、临床分期较晚的患者PD-L1阳性率较高(P均＜0.05，表 1)。

图 1 NSCLC患者癌组织及癌旁组织PD-L1免疫组织化学染色 Fig 1 PD-L1 immunohistochemistry staining of cancer tissues and paracancerous tissues in NSCLC patients A: Paracancerous tissue; B: Poorly differentiated lung adenocarcinoma tissue. NSCLC: Non-small cell lung cancer; PD-L1: Programmed death ligand 1. Original magnification: ×200

表 1 NSCLC患者癌组织PD-L1表达与临床病理特征的关系 Tab 1 Association between PD-L1 expression in cancer tissues and clinicopathological features of NSCLC patients  

2.2 NSCLC癌组织miRNA-200家族表达水平及其与PD-L1的关系

qRT-PCR检测结果显示，患者癌组织中miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429、miRNA-141表达水平均低于癌旁组织(P均＜0.01，图 2A)，以miRNA-200a、miRNA-429和miRNA-141为最显著。进一步分析这些miRNA表达水平与癌组织PD-L1表达的关系，发现PD-L1表达阳性的患者具有更低水平的miRNA-200家族表达(P均＜0.01，图 2B)。

图 2 qRT-PCR检测NSCLC患者癌组织miRNA-200家族的表达及其与PD-L1的关系 Fig 2 qRT-PCR analysis of miRNA-200 family expression and its relationship with PD-L1 in cancer tissues of NSCLC patients A: Expression levels of miRNA-200 family in NSCLC tissues and paracancerous tissues (n＝138); B: Expression of miRNA-200 family in NSCLC tissues with PD-L1 positive (n＝81) and negative (n＝57) expression. qRT-PCR: Quantitative real-time polymerase chain reaction; NSCLC: Non-small cell lung cancer; miRNA: microRNA; PD-L1: Programmed death ligand 1. **P < 0.01. x±s

2.3 肺癌细胞过表达miRNA-200家族能下调PD-L1表达

qRT-PCR检测结果显示，A549细胞转染miRNA-200家族模拟物后，miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429、miRNA-141表达水平均较阴性对照组升高(P均＜0.01，图 3A)。蛋白质印迹检测结果显示，这些miRNA模拟物均能下调PD-L1表达(P均＜0.01，图 3B)。

图 3 肺癌细胞A549过表达miRNA-200家族对PD-L1表达的影响 Fig 3 Impact of miRNA-200 family overexpression on PD-L1 expression in lung cancer A549 cells A: qRT-PCR analysis demonstrated that miRNA-200 family was highly expressed following transfection with miRNA-200 family mimics in A549 cells; B: Western blotting analysis showed that the expression of PD-L1 decreased following transfection with miRNA-200 family mimics in A549 cells. miRNA: microRNA; NC: Negative control; PD-L1: Programmed death ligand 1; qRT-PCR: Quantitative real-time polymerase chain reaction; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. **P < 0.01 vs miRNA-NC group. n＝3, x±s

2.4 肺癌细胞A549过表达miRNA-200家族能抑制细胞的增殖活性

CCK-8实验结果显示，A549细胞转染阴性对照miRNA后24、48、72 h，细胞存活率基本保持平稳，说明转染过程本身不会对细胞存活率造成明显影响。A549细胞转染miRNA-200家族模拟物后，癌细胞存活率随时间延长而逐渐下降，72 h时与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P均＜0.01)，其中miRNA-429、miRNA-141和miRNA-200a的作用最显著(图 4)。

图 4 CCK-8实验检测肺癌细胞A549过表达miRNA-200家族对细胞增殖活性的抑制作用 Fig 4 CCK-8 assay indicated that miRNA-200 family overexpression inhibited the proliferation of lung cancer A549 cells CCK-8: Cell counting kit-8; miRNA: microRNA; NC: Negative control. **P < 0.01 vs miRNA-NC group. n＝3, x±s

2.5 PD-L1是miRNA-200家族的靶基因

荧光素酶报告基因实验证实，miRNA-200a和miRNA-141模拟物能使pGL3-F1的荧光素酶活性下降，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P均＜0.01)，但对pGL3-F2的荧光素酶活性无影响；miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-429模拟物能使pGL3-F2的荧光素酶活性下降，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P均＜0.01)，但对pGL3-F1的荧光素酶活性无影响(图 5)。

图 5 荧光素酶报告基因实验证实PD-L1是miRNA-200家族靶基因 Fig 5 Luciferase assay confirmed that PD-L1 was the target gene of miRNA-200 family PD-L1: Programmed death ligand 1; miRNA: microRNA; NC: Negative control. pGL3-F1: The luciferase reporter vector contains miRNA-200a and miRNA-141 binding sites; pGL3-F2: The luciferase reporter vector contains miRNA-200b, miRNA-200c and miRNA-429 binding sites. **P < 0.01 vs miRNA-NC group. n＝3, x±s

上述结果提示，PD-L1是miRNA-200家族的靶基因，miRNA-200家族能下调PD-L1的表达，但5个miRNA-200家族成员的作用位点不同，miRNA-200a和miRNA-141共同作用于一个序列区，miRNA-200b、miRNA-200c和miRNA-429共同作用于一个序列区。

3 讨论

PD-L1是一种相对分子质量为40 000的Ⅰ型跨膜蛋白，由CD274基因编码，因此又称为CD274或B7同源物1(B7 homolog 1，B7-H1)。PD-L1的主要功能是与其受体PD-1结合传递免疫抑制信号，减少淋巴结中抗原特异性CD8+ T淋巴细胞的增殖[6]。PD-L1在多种肿瘤中均有表达，特别是NSCLC、胃癌、胶质细胞瘤、黑素瘤、肾癌、前列腺癌、肝癌等[7-8]。在肿瘤细胞表面表达的PD-L1与T淋巴细胞表达的PD-1相互作用，能够保证肿瘤细胞的免疫逃避功能，促使肿瘤细胞生长。抑制PD-L1/PD-1通路能够提高CD8+ T细胞功能，并抑制调节性T淋巴细胞功能，从而达到抗肿瘤的目的[9]。根据这个原理，已开发出PD-L1或PD-1抗体类药物，用来阻断PD-L1与PD-1的相互作用，并因此增强宿主抗肿瘤免疫应答、抑制肿瘤生长。目前，已有多种抗PD-L1和抗PD-1的抗体被批准用于临床试验或临床前研究中，并表现出令人期待的效果[10-11]。

关于NSCLC中PD-L1的表达已有较多文献报道，但各结果间差异较大。Miyazawa等[12]研究表明，PD-L1在肺鳞癌(44%)和大细胞癌(67%)中阳性率高于腺癌(21%)；在腺癌的各亚型中，PD-L1阳性率在腺泡型腺癌为57%，实体型腺癌为55%，明显高于乳头型腺癌和腺泡型腺癌。该研究还发现，PD-L1阳性表达与男性(P＝0.001)、吸烟者(P＝0.027)、病理分期晚(P＝0.018)、静脉浸润阳性(P＝0.001)、淋巴管浸润阳性(P＝0.011)等相关，但与年龄、临床分期、胸膜浸润、表皮生长因子受体突变不相关。本研究通过免疫组织化学染色对138例NSCLC的癌组织及癌旁组织PD-L1进行检测，发现癌组织中PD-L1总阳性率为58.7%(81/138)，大细胞癌阳性率(66.7%，10/15)略高于鳞癌(57.9%，33/57)和腺癌(57.6%，38/66)。PD-L1的表达水平与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型不相关，而与淋巴结转移、脉管侵犯、临床TNM分期密切相关，有淋巴结转移、有微血管和淋巴管侵犯、临床分期较晚的患者PD-L1阳性率明显升高。本研究结果提示，PD-L1可能与NSCLC的恶性进展密切相关。

PD-L1阳性表达的调控机制非常复杂，还有很多影响因素没有确定。研究发现，PD-L1受很多癌基因和抑癌基因调控，如PD-L1的表达会被抑癌基因PTEN抑制，在神经胶质瘤中敲除PTEN则能够通过激活PI3K/AKT下游mTOR-S6K1信号通路增加PD-L1的转录表达[13]。此外，PD-L1在肺癌细胞中与miRNA的关系也极为密切，一些miRNA如miRNA-34、miRNA-200、miRNA-197等能显著影响PD-L1抗体的疗效[14]。研究PD-L1和miRNA之间的关系将有助于阐明PD-L1表达的调控机制和研发有效的靶向治疗策略。

为深入研究NSCLC中PD-L1表达差异的影响因素及其机制，本研究检测了138例NSCLC中miRNA-200家族5个miRNA(miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-429、miRNA-141)的表达，发现NSCLC中miRNA-200家族水平均低于癌旁组织，并且这些miRNA均与PD-L1存在反向平行关系，即PD-L1表达阳性的患者具有更低水平的miRNA-200家族表达，提示miRNA-200家族与PD-L1表达相关。本研究在高表达PD-L1的肺癌细胞A549中过表达miRNA-200家族，发现随miRNA-200家族水平升高PD-L1表达水平下调，提示miRNA-200家族能负调控NSCLC细胞的PD-L1表达，而且这种负调控抑制了癌细胞的增殖活性。荧光素酶报告基因检测结果确认PD-L1是miRNA-200家族全部5个miRNA的靶基因，但其作用位点有所不同。本研究结果阐明PD-L1受miRNA-200家族的直接调控，为设计NSCLC靶向治疗策略提供了参考依据。

志谢  南通大学附属医院为本研究提供病例资料和标本，特此感谢！

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