支气管哮喘是儿童最常见的慢性呼吸道疾病之一，在我国14岁以下儿童中支气管哮喘的累积患病率高达3.02%^[1]。哮喘患儿主要的临床症状表现为反复发作的喘息、胸闷与咳嗽等，这些症状严重危害着患儿的身心健康^[2-3]。LncRNA是一类长度超过200 nt的非编码RNA，广泛存在于真核细胞并通过转录调控、转录后调控和表观遗传调控参与多种复杂的生理病理活动^[4-5]。LncRNA INK4位点反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)最初因与冠状动脉粥样硬化密切相关而被报道，近年来，有研究表明其可通过调控miRNA参与包括癌症、心血管疾病与炎症免疫性疾病在内的多种疾病的发生与发展^[6-8]。研究显示，lncRNA ANRIL/miRNA-125a轴在口腔癌和鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭过程中发挥着重要作用^[9-10]，miRNA-125a还可以介导多种免疫细胞的活动与免疫介质的释放，并参与类风湿关节炎、克罗恩病和系统性红斑狼疮等炎症免疫性疾病的发生、发展^[11-14]。支气管哮喘患儿体内广泛存在炎症免疫损伤，我们前期小样本预试验结果显示支气管哮喘患儿血浆中lncRNA ANRIL上调、miRNA-125a下调，并且二者呈负相关，因此推测lncRNA ANRIL/miRNA-125a轴在儿童支气管哮喘发病和进展过程中起着重要作用。本研究旨在评估lncRNA ANRIL在支气管哮喘患儿血浆中的表达及其与患病风险、疾病严重程度和miRNA-125a表达的关系。

连续选择2017年1月至2018年6月在武汉市第四医院就诊的急性发作期支气管哮喘患儿70例、缓解期支气管哮喘患儿70例，并选择70例同期于武汉市第四医院健康体检中心进行健康体检的健康儿童作为健康对照。本研究通过武汉市第四医院伦理委员会审批，入组前所有受试者法定监护人均签署了知情同意书。

急性发作期支气管哮喘患儿纳入标准如下：(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》急性发作期支气管哮喘诊断标准^[1]；(2)年龄＜16岁^[15]。排除标准：(1)除呼吸道或肺部感染外合并其他器官组织严重感染者；(2)合并恶性血液病或肿瘤者。

缓解期支气管哮喘患儿纳入标准如下：(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》缓解期支气管哮喘诊断标准^[1]；(2)经过治疗或未经治疗症状、体征消失，肺功能恢复至急性发作前水平并维持3个月以上；(3)年龄＜16岁^[15]。排除标准与急性发作期支气管哮喘患儿一致。

健康儿童纳入标准如下：(1)年龄、性别、身高、体质量与入组支气管哮喘患儿相匹配；(2)无哮喘病史及过敏性疾病史。排除标准：(1)1个月内使用过免疫抑制剂或糖皮质激素类药物；(2)患有感染、炎症性疾病、血液系统疾病或恶性肿瘤。

在取得法定监护人书面知情同意后，收集所有受试者的年龄、性别、身高、体质量、家族哮喘病史等基本信息，并记录实验室检查结果和肺通气功能检测结果，包括嗜酸性粒细胞计数、IgE水平、第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV₁)/用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、FEV₁占预计值的百分比(FEV₁%Pred)等。同时，对于急性发作期支气管哮喘患儿，入院时哮喘急性发作严重程度依据《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》^[1]进行评估并记录。

所有受试者入组后均采集血液样本，并在1 min内离心分离血浆。使用TRIzol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取血浆总RNA，用反转录试剂盒(德国Qiagen公司)反转录为cDNA。以cDNA为模板，分别使用lncRNA ANRIL和miRNA-125a特异性引物进行qRT-PCR。以GAPDH作为lncRNA ANRIL内参，以U6作为miRNA-125a内参，采用2^-ΔΔCt方法分别计算lncRNA ANRIL和miRNA-125a mRNA相对表达水平。LncRNA ANRIL正义引物：5'-TGC TCT ATC CGC CAA TCA GG-3'，反义引物：5'-GGG CCT CAG TGG CAC ATA CC-3'；miRNA-125a正义引物：5'-ACA CTC CAG CTG GGT CCC TGA GAC CCT TTA AC-3'，反义引物：5'-TGT CGT GGA GTC GGC AAT TC-3'；GAPDH正义引物：5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，反义引物：5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'；U6正义引物：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA-3'，反义引物：5'-ACG AAT TTG CGT GTC ATC CTT GC-3'。

采用ELISA试剂盒(英国Abcam公司)检测血浆中炎性因子(TNF-α、lL-1β、IL-6和IL-17)水平，所有操作均严格按照试剂盒使用说明书进行。

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析，使用GraphPad Prism 6.01软件绘图。呈正态分布的计量资料以x±s表示，呈偏态分布或未知分布的计量资料以中位数(下四分位数，上四分位数)表示，计数资料以例数和百分数表示。3组间比较采用单因素方差分析、Kruskal-Wallis H检验或χ²检验，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析，lncRNA ANRIL对支气管哮喘的诊断及其急性发作的判断价值采用ROC曲线评估。双侧检验，检验水准(α)为0.05。

急性发作期支气管哮喘患儿的年龄为2~14(6.4±2.7)岁，男36例、女34例，身高为(116.2±16.8)cm，体质量为(22.9±7.8)kg，有家族哮喘病史者20例(28.6%)。缓解期支气管哮喘患儿的年龄为3~14(6.6±2.4)岁，男38例、女32例，身高为(117.3±15.7)cm，体质量为(23.2±7.3)kg，有家族哮喘病史者16例(22.9%)。健康儿童年龄为3~14(7.4±2.6)岁，男42例、女28例，身高为(116.7±16.5)cm，体质量为(23.4±7.9)kg，有家族哮喘病史者9例(12.9%)。3组受试者年龄、性别、身高、体质量及有家族哮喘病史者比例的差异均无统计学意义(P均＞0.05)。

LncRNA ANRIL在急性发作期支气管哮喘患儿血浆中的表达水平[3.078(2.211，3.977)]高于缓解期支气管哮喘患儿[1.536(0.891，2.880)]和健康儿童[1.004(0.464，1.967)]，差异均有统计学意义(P均＜0.001)；同时，其在缓解期支气管哮喘患儿血浆中的表达水平高于健康儿童(P＝0.002)；见图 1A。ROC曲线表明lncRNA ANRIL可以鉴别哮喘急性发作期和缓解期(AUC＝0.759，95% CI 0.678~0.840，图 1B)，也可诊断急性发作期哮喘(AUC＝0.873，95% CI 0.814~0.933，图 1C)及缓解期哮喘(AUC＝0.650，95% CI 0.560~0.741，图 1D)。以上结果表明lncRNA ANRIL对儿童支气管哮喘及急性发作期、缓解期具有诊断价值。

图 1 3组受试者血浆中lncRNA ANRIL的相对表达量及ROC曲线 Fig 1 Relative expression of lncRNA ANRIL in plasma of participants in three groups and ROC curves A: LncRNA ANRIL expression (n=70 in each group, median [low quartile, upper quartile]; B: ROC curve of asthma exacerbation children vs asthma remission children; C: ROC curve of asthma exacerbation children vs healthy controls; D: ROC curve of asthma remission children vs healthy controls. LncRNA: Long non-coding RNA; ANRIL: Antisense non-coding RNA in the INK4 locus; ROC: Receiver operating characteristic; AUC: Area under curve; CI: Confidence interval

LncRNA ANRIL在急性发作期支气管哮喘轻度患儿(n＝18)血浆中的表达水平为2.283(1.484，3.096)，在中重度患儿(n＝37)血浆中的表达水平为3.184(2.502，3.990)，在重度患儿(n＝15)血浆中的表达水平为4.137(2.643，5.847)，Kruskal-Wallis H检验表明急性发作期支气管哮喘患儿血浆中lncRNA ANRIL表达水平与疾病严重程度有关(H＝15.120，P＝0.001)。表明急性发作期支气管哮喘患儿血浆中lncRNA ANRIL水平越高病情越重。

在急性发作期支气管哮喘患儿中，血浆lncRNA ANRIL表达水平与FEV₁/FVC(r＝-0.344，P＝0.003)和FEV₁%Pred(r＝-0.273，P＝0.022)呈负相关，而与嗜酸性粒细胞计数(r＝0.144，P＝0.236)和IgE(r＝0.111，P＝0.361)无关；在缓解期支气管哮喘患儿和健康儿童中，血浆lncRNA ANRIL表达水平与嗜酸性粒细胞计数、IgE、FEV₁/FVC及FEV₁%Pred均无关(P均＞0.05)。见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 3组受试者血浆中lncRNA ANRIL和miRNA-125a的相对表达量与临床特征及炎性因子的关系 Tab 1 Correlation of relative expression of lncRNA ANRIL and miRNA-125a in plasma of participants in three groups with the clinical characteristics and inflammatory cytokines Item Asthma exacerbation Asthma remission Healthy control lncRNA ANRIL miRNA-125a lncRNA ANRIL miRNA-125a lncRNA ANRIL miRNA-125a Eosinophil count r＝0.144 P＝0.236 r＝-0.162 P＝0.181 r＝0.077 P＝0.529 r＝-0.145 P＝0.233 r＝0.089 P＝0.465 r＝0.211 P＝0.079 IgE r＝0.111 P＝0.361 r＝-0.075 P＝0.535 r＝0.097 P＝0.426 r＝-0.233 P＝0.052 r＝-0.093 P＝0.443 r＝0.074 P＝0.543 FEV1/FVC r＝-0.344 P＝0.003 r＝0.502 P＜0.001 r＝0.228 P＝0.058 r＝-0.129 P＝0.286 r＝0.036 P＝0.766 r＝-0.225 P＝0.061 FEV1%Pred r＝-0.273 P＝0.022 r＝0.510 P＜0.001 r＝-0.013 P＝0.913 r＝-0.047 P＝0.698 r＝0.028 P＝0.815 r＝-0.019 P＝0.878 TNF-α r＝0.358 P＝0.002 r＝-0.331 P＝0.005 r＝0.282 P＝0.018 r＝-0.256 P＝0.032 r＝0.202 P＝0.093 r＝-0.210 P＝0.081 IL-1β r＝0.312 P＝0.008 r＝-0.318 P＝0.007 r＝0.243 P＝0.043 r＝-0.200 P＝0.098 r＝0.155 P＝0.200 r＝-0.213 P＝0.077 IL-6 r＝0.270 P＝0.024 r＝-0.205 P＝0.089 r＝0.230 P＝0.056 r＝-0.225 P＝0.061 r＝0.279 P＝0.019 r＝-0.269 P＝0.024 IL-17 r＝0.422 P＜0.001 r＝-0.250 P＝0.037 r＝0.338 P＝0.004 r＝-0.376 P＝0.001 r＝0.199 P＝0.098 r＝-0.266 P＝0.026 LncRNA: Long non-coding RNA; ANRIL: Antisense non-coding RNA in the INK4 locus; miRNA: microRNA; IgE: Immunoglobulin E; FEV1: Forced expiratory volume in one second; FVC: Forced vital capacity; FEV1%Pred: FEV1 as percentage of predicted; TNF-α: Tumor necrosis factor α; IL: Interleukin

表 1 3组受试者血浆中lncRNA ANRIL和miRNA-125a的相对表达量与临床特征及炎性因子的关系 Tab 1 Correlation of relative expression of lncRNA ANRIL and miRNA-125a in plasma of participants in three groups with the clinical characteristics and inflammatory cytokines

在急性发作期支气管哮喘患儿中，血浆lncRNA ANRIL表达水平与TNF-α(r＝0.358，P＝0.002)、IL-1β(r＝0.312，P＝0.008)、IL-6(r＝0.270，P＝0.024)和IL-17(r＝0.422，P＜0.001)表达水平呈正相关，在缓解期支气管哮喘患儿中其与TNF-α(r＝0.282，P＝0.018)、IL-1β(r＝0.243，P＝0.043)和IL-17(r＝0.338，P＝0.004)表达水平呈正相关，同时在健康儿童中其与IL-6表达水平(r＝0.279，P＝0.019)呈正相关。见表 1。

在急性发作期支气管哮喘患儿(r＝-0.430，P＜0.001)、缓解期支气管哮喘患儿(r＝-0.240，P＝0.045)和健康儿童(r＝-0.308，P＝0.010)中，血浆lncRNA ANRIL表达水平与miRNA-125a表达均呈负相关。

在急性发作期支气管哮喘患儿中，miRNA-125a表达水平与FEV₁/FVC(r＝0.502，P＜0.001)和FEV₁%Pred(r＝0.510，P＜0.001)呈正相关，而与TNF-α(r＝-0.331，P＝0.005)、IL-1β(r＝-0.318，P＝0.007)和IL-17(r＝-0.250，P＝0.037)表达水平呈负相关。在缓解期支气管哮喘患儿中，miRNA-125a表达水平与TNF-α(r＝-0.256，P＝0.032)、IL-17(r＝-0.376，P＝0.001)表达水平呈负相关。在健康儿童中，miRNA-125a表达水平与IL-6(r＝-0.269，P＝0.024)、IL-17(r＝-0.266，P＝0.026)表达水平呈负相关。见表 1。

ANRIL基因位于染色体9p21.3，其转录产物lncRNA ANRIL与多种炎症性疾病的患病风险和严重程度相关^[7-16]。Abd-Elmawla等^[16]发现lncRNA ANRIL对系统性红斑狼疮具有诊断价值且可作为系统性红斑狼疮患者疾病进展的标志物。此外，还有研究表明冠心病患者中lncRNA ANRIL表达显著上调并与三酰甘油和胆固醇水平呈正相关，与患者总生存期呈负相关，表明lncRNA ANRIL对冠心病患者疾病严重程度和预后有预测价值；同时，细胞实验表明lncRNA ANRIL可以促进人冠状动脉内皮细胞IL-6、IL-8及TNF-α等炎性因子的表达，提示其可能通过促炎介质加重冠心病进展^[7]。本研究中，lncRNA ANRIL表达水平在健康儿童、缓解期支气管哮喘患儿和急性发作期支气管哮喘患儿中依次升高，且其对儿童支气管哮喘及急性发作有诊断价值。与现有的儿童支气管哮喘诊断方法(体征、症状和肺功能检查结果)相比，lncRNA ANRIL具有易检测、可操作性强、灵敏度高等优势，具有一定的临床应用价值。本研究结果还显示lncRNA ANRIL表达水平与急性发作期支气管哮喘患儿疾病严重程度有关，并与炎性因子水平呈正相关，表明它也能够预测哮喘患儿疾病进展与炎症水平。可能的原因为：(1)lncRNA ANRIL通过“海绵作用”调控miRNA-125a促进嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等释放炎症介质(如IL-1β、IL-6和TNF-α等)，加重炎症反应进而降低患儿呼吸功能，加重哮喘严重程度。(2)Guo等^[7]发现lncRNA ANRIL通过调控miRNA-181b促进人冠状动脉内皮细胞炎症介质的表达和释放加重内皮细胞损伤，而Huo等^[17]发现下调miRNA-181b表达水平可以加重哮喘患者呼吸道中嗜酸性粒细胞介导的炎症反应，因此我们推测lncRNA ANRIL也可能通过降低miRNA-181b表达促进哮喘患儿体内炎症反应，降低呼吸功能并加重病情。考虑支气管哮喘急性发作可能由感染触发并加重，lncRNA ANRIL与急性发作期支气管哮喘严重程度有关的原因和具体机制有待进一步分析。

近年来，研究发现lncRNA ANRIL通过靶向调控miRNA-125a促进口腔癌和鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭^[9-10]。同时，许多证据表明miRNA-125a可以调控多种免疫细胞(如调节性T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等)的功能影响炎症性疾病的发生、发展^[11-14]。因此，我们推测lncRNA ANRIL可能会靶向调控miRNA-125a表达增加儿童支气管哮喘的患病风险、炎症水平和严重程度，然而目前尚无相关报道。本研究中，3组受试者血浆中lncRNA ANRIL表达水平均与miRNA-125a表达水平呈负相关；同时，在急性发作期支气管哮喘患儿中miRNA-125a表达水平与肺通气功能呈正相关，而与炎性因子水平呈负相关，表明lncRNA ANRIL可能通过下调miRNA-125a的表达促进并加重儿童支气管哮喘的发生、发展。可能的原因为：(1)lncRNA ANRIL通过“海绵作用”调控miRNA-125a并下调其表达，因此lncRNA ANRIL表达水平与miRNA-125a呈负相关。(2)miRNA-125a通过调控多种免疫细胞的活性抑制炎症介质的表达和释放来改善急性发作期支气管哮喘患儿的呼吸功能^[11-12]，因此在急性发作期支气管哮喘患儿中miRNA-125a表达水平与肺通气功能呈正相关而与炎性因子水平呈负相关。

本研究尚有一些不足。LncRNA ANRIL可通过靶向调控miRNA-125a的表达促进儿童支气管哮喘的发生、发展，然而其具体的分子生物学机制尚未验证。同时，尽管本研究结果为探索lncRNA ANRIL和miRNA-125a在儿童支气管哮喘中的作用提供了一定的依据，但是，由于受试者特别是健康儿童的支气管黏膜样本不方便获取，本研究测定的lncRNA ANRIL和miRNA-125a表达水平均为血浆中的浓度而不是支气管黏膜中的浓度，容易引入混杂因素。因此，进一步研究支气管黏膜中lncRNA ANRIL和miRNA-125a的表达水平并评估它们与患儿支气管哮喘患病风险和严重程度的关系非常重要。此外，本研究样本量较小，有可能降低统计学效能，今后将开展大样本研究。

综上所述，lncRNA ANRIL对儿童支气管哮喘及急性发作有诊断价值，对哮喘严重程度和患儿炎症水平有潜在的预测价值。LncRNA ANRIL可能通过靶向调控miRNA-125a参与儿童支气管哮喘的发生、发展，其具体机制需要进一步研究。