第二军医大学学报  2020, Vol. 41 Issue (4): 424-428   PDF    
穿透素3对转化生长因子β1诱导的眼眶成纤维细胞纤维化的影响
刁嘉乐, 魏锐利     
海军军医大学(第二军医大学)长征医院眼科, 上海 200003
摘要: 目的 探索穿透素3(PTX3)对TGF-β诱导的眼眶成纤维细胞(OF)纤维化的作用。方法 以体外培养的甲状腺相关眼病(TAO)患者来源及健康来源OF为研究对象,在培养液中加入人重组PTX3(rhPTX3)蛋白(1 μg/mL)及重组TGF-β1(10 ng/mL)进行刺激,刺激完成后选择特异性抗体标记细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),通过免疫荧光显微镜观察OF的纤维化程度变化。给予细胞相同的刺激,刺激后通过qRT-PCR检测细胞中α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白α1(ColIα1)、IL-6 mRNA表达量的变化。结果 TGF-β1可诱导两组OF中α-SMA蛋白表达量增加,细胞呈现纤维化改变,而rhPTX3对该效应未见明显抑制作用。TAO患者来源OF的纤维化效应较健康来源OF无明显差异。TGF-β1可诱导OF纤维化相关蛋白(α-SMAColIα1IL-6)mRNA表达上调。rhPTX3对OF中α-SMA mRNA的表达无明显诱导作用,但共刺激时可增强TGF-β1对α-SMA mRNA的上调效应。rhPTX3可上调ColIα1IL-6 mRNA的表达,共刺激时可增强TGF-β1对IL-6 mRNA的诱导上调,但对ColIα1 mRNA的上调未见明显影响。结论 rhPTX3对TGF-β1诱导的OF纤维化过程具有潜在的促进作用,说明PTX3可能参与了TAO患者后期视物重影的发病过程,并发挥了正向作用。
关键词: 穿透素3    甲状腺相关眼病    眼眶成纤维细胞    转化生长因子β    纤维化    
Effect of pentraxin 3 on transforming growth factor β1-induced fibrosis in orbital fibroblasts
DIAO Jia-le, WEI Rui-li     
Department of Ophthalmology, Changzheng Hospital, Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200003, China
Abstract: Objective To explore the role of pentraxin 3 (PTX3) in transforming growth factor β1 (TGF-β1)-induced fibrosis in orbital fibroblasts (OFs). Methods OFs from thyroid-associated ophthalmopathy (TAO) patients and healthy donors were cultured in vitro. The human recombinant PTX3 (rhPTX3) (1 μg/mL) and human recombinant TGF-β1 (10 ng/mL) were added to the culture medium for stimulation. After stimulation, specific antibody was selected to label the anti-α-smooth muscle actin (α-SMA), and the fibrosis of OFs was observed by fluorescence microscope. The mRNA expression levels of α-SMA, collagen typeⅠα1 (ColIα1) and interleukin 6 (IL-6) were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction after the same stimulation. Results TGF-β1 induced the expression of α-SMA protein in the two groups of OFs, and the cells showed fibrotic changes, while the rhPTX3 had no significant inhibition. There was no significant difference in the fibrotic effect of OFs between the patients with TAO and healthy donors. The mRNA expression levels of fibrotic protein (α-SMA, ColIα1, and IL-6) were upregulated by TGF-β1 in OFs. The rhPTX3 had no significant induction for the expression of α-SMA mRNA in OFs, but co-stimulation could significantly enhance the upregulation of α-SMA. The rhPTX could upregulate the mRNA expression of ColIα1 and IL-6. Co-stimulation could enhance the induction of upregulation of IL-6 by TGF-β1, but had no significant effect on the upregulation of ColIα1. Conclusion The rhPTX3 has a potential role in promoting TGF-β1-induced fibrosis in OFs, which indicates that PTX3 may be involved in the later stage of the pathogenesis of diplopia in TAO patients and play a positive role.
Key words: pentraxin 3    thyroid associated ophthalmopathy    orbital fibroblasts    transforming growth factor β    fibrosis    

甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是成人最常见的眼眶病之一,与甲状腺自身免疫异常密切相关[1]。眼外肌功能障碍导致的视物重影是TAO较为常见的临床表现之一,对患者生活质量影响较大,通常发生于疾病后期及眼眶减压术后[2]。TAO的发病机制尚不明确,就目前研究结果来看,眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast,OF)是患者眼眶内病理改变的基础,TGF-β诱导的OF纤维化也是患者视物重影的主要原因[3]

在以往的研究中,我们发现穿透素3(pentraxin 3,PTX3)作为一种体液免疫中的模式识别分子,在TAO患者眼眶脂肪结缔组织及血液中高表达[4],同时促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以诱导OF表达PTX3[5],因此我们认为PTX3与TAO的发病高度相关。研究发现PTX3参与人体皮肤创伤修复、特发性肺纤维化及肾间质纤维化等多个病理生理过程[6-7],但PTX3在TAO后期纤维化中的作用尚未见报道。本研究拟应用人重组PTX3(human recombinant PTX3,rhPTX3)蛋白和重组TGF-β1刺激体外培养的OF,探索PTX3对TGF-β1诱导的OF纤维化过程的影响。

1 材料和方法 1.1 样本收集

本研究所纳入的TAO患者来源OF取自2018年7月至2019年2月在我科行眼眶减压术的TAO患者,共3例3眼,女2例、男1例,年龄27~45岁,均按照欧洲Graves眼病专家组(European Group on Graves’ Orbitopathy,EUGOGO)标准[8]确诊TAO,患者术前甲状腺功能稳定6个月以上,眼部情况稳定6个月以上,无放射治疗史,未行大剂量糖皮质激素冲击治疗或停用6个月以上。健康来源OF取自2018年8月至2019年1月在我科行上睑下垂矫正术及眼袋整形术的患者,共3例3眼,女2例、男1例,年龄29~34岁,排除自身免疫性疾病及其他眼病,根据患者病情于术中取得脱出眶隔的脂肪结缔组织标本。本研究经海军军医大学(第二军医大学)生物医学伦理委员会审批,患者及家属签署知情同意书后获取相关标本。

1.2 试剂和仪器

DMEM高糖培养液、FBS及0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液购自美国Gibco公司,青霉素-链霉素溶液(100×)购自上海碧云天生物技术有限公司,TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,无水乙醇及甲醇购自上海国药集团,TB Green® Premix Ex TaqTM和PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司,人重组TGF-β1购自美国Peprotech公司,rhPTX3蛋白和重组α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体购自英国Abcam公司。

低温超速离心机(德国Hettich公司),超净工作台和CO2恒温培养箱(美国Thermo公司),倒置相差显微镜(日本Nikon公司),ABI 7900HT荧光定量PCR仪和普通PCR仪(美国ABI公司),荧光分光光度计(美国NanoDrop公司)。

1.3 OF培养

手术中取下眼眶脂肪结缔组织标本后,于无菌条件下迅速转移至盛有含20% FBS和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养液的离心管中。将离心管置入冰水混合物中,快速转运(1 h内)至细胞房超净台(超净台经紫外线消毒30 min)。采用经典组织块培养法培养细胞并传代,第4~10代OF用于后续实验。

1.4 实验分组

用含1% FBS的培养液饥饿处理细胞12 h后,分别将TAO患者来源OF和健康来源OF分为4组:空白组加入完全培养液处理细胞;rhPTX3组加入含1 μg/mL rhPTX3的完全培养液处理细胞;TGF-β1组加入含10 ng/mL TGF-β1的完全培养液处理细胞;rhPTX3+TGF-β1组加入含1 μg/mL rhPTX3和10 ng/mL TGF-β1的完全培养液处理细胞。

1.5 细胞免疫荧光实验

按照实验分组将OF以每孔3×104个细胞的密度接种到96孔细胞培养板中,并置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱孵育至细胞贴壁融合生长。细胞处理完成后,吸弃原有培养液后加入100 μL甲醇,置于-20 ℃进行细胞固定。用0.1% Triton X-100(PBS配制)溶液完成细胞透化后,封闭非特异性抗原位点。室温下依次孵育特异性一抗及二抗,DAPI染核后于荧光显微镜下观察。

1.6 qRT-PCR

采用TRIzol法提取细胞总RNA,经PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA后,应用TB Green® Premix Ex TaqTM试剂盒配制反应体系,384孔板加样离心混匀后进行PCR反应,用SDS 2.4软件分析目的基因相对表达量。具体实验方法见各试剂盒说明书。该部分实验所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成,具体序列如下:α-SMA上游引物5′-GGT GAT GGT GGG AAT GGG-3′,下游引物5′-GCA GGG TGG GAT GCT CTT-3′;GAPDH上游引物5′-TTG CCA TCA ATG ACC CCT A-3′,下游引物5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3′;Ⅰ型胶原蛋白α1(collagen typeⅠα1,ColIα1)上游引物5′-GAG GGC CAA GAC GAA GAC ATC-3′,下游引物5′-CAG ATC ACG TCA TCG CAC AAC-3′;IL-6上游引物5′-ACT CAC CTC TTC AGA ACG AAT TG-3′,下游引物5′-CCA TCT TTG GAA GGT TCA GGT TG-3′。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.04软件绘图,SPSS 21.0软件进行统计学分析。数据以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检验标准(α)为0.05。

2 结果 2.1 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的OF分化的影响

细胞免疫荧光实验结束(图 1)显示,OF培养5 d后,空白组中OF均为纺锤形、低荧光的正常成纤维细胞形态;rhPTX3组OF细胞形态及α-SMA蛋白表达未发生明显变化;TGF-β1组OF形态明显改变,α-SMA蛋白强阳性、表达增加,说明其已分化为肌成纤维细胞并发生纤维化;rhPTX3+TGF-β1组与TGF-β1组相比没有明显改变,且TAO患者来源OF和健康来源OF对TGF-β1和rhPTX3的反应无明显差异。

图 1 rhPTX3对TGF-β1诱导的OF向肌成纤维细胞分化的影响 Fig 1 Effect of rhPTX3 on TGF-β1-induced fibrosis in OFs Green fluorescence showing positive expression of α-smooth muscle actin. rhPTX3: Human recombinant pentraxin 3; TGF-β1: Transforming growth factor β1; OF: Orbital fibroblast; H-OF: OF cultured from healthy donors; TAO-OF: OF cultured from patients with thyroid-associated ophthalmopathy. Original magnification: ×100

2.2 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的ColIα1α-SMA mRNA表达的影响

结果如图 2A所示,TGF-β1上调OF内α-SMA mRNA的表达量(相当于对照组的7.97±0.69倍,P<0.01),rhPTX3本身对α-SMA mRNA的表达无明显影响,但与TGF-β1共处理OF可增强TGF-β1对α-SMA的诱导作用,α-SMA mRNA的表达量上升(相当于对照组的18.43±1.23倍,P<0.01);rhPTX3对ColIα1 mRNA的表达并没有表现出类似的效应(图 2B),rhPTX3、TGF-β1及两者共同刺激均可上调ColIα1 mRNA表达(分别相当于对照组的3.27±0.35、2.69±0.32、3.24±0.18倍,与对照组比较P<0.01),但3组间差异无统计学意义。

图 2 rhPTX3对OF内α-SMAColIα1 mRNA表达的影响 Fig 2 Effect of rhPTX3 on α-SMA and ColIα1 mRNA expression in OFs rhPTX3: Human recombinant pentraxin 3; OF: Orbital fibroblast (cultured from healthy donors); α-SMA: α-smooth muscle actin; ColⅠα1: Collagen typeⅠα1; TGF-β1: Transforming growth factor β1. **P < 0.01 vs control group; △△P < 0.01 vs TGF-β1 group. n=3, x±s

2.3 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的IL-6 mRNA表达的影响

TGF-β1和rhPTX3均上调OF内IL-6 mRNA的表达量,分别相当于对照组的93.33±19.22倍和121.25±18.81倍(P均<0.01)。rhPTX3与TGF-β1共处理OF组IL-6 mRNA表达的上调幅度远远超过两者单独作用的诱导效应之和,相当于对照组的549.32±59.69倍(P<0.01)。见图 3

图 3 rhPTX3对OF内IL-6 mRNA表达的影响 Fig 3 Effect of rhPTX3 on IL-6 mRNA expression in OFs rhPTX3: Human recombinant pentraxin 3; OF: Orbital fibroblast (cultured from healthy donors); IL-6: Interleukin 6; TGF-β1: Transforming growth factor β1. **P<0.01 vs control group. n=3, x±s

3 讨论

自20世纪90年代研究者发现TGF-β可以诱导OF产生黏多糖并发生纤维化改变[9]以来,对TAO发病过程中纤维化的探索均围绕这一病理过程展开。近年有研究发现TGF-β1可以诱导TAO患者来源OF中鞘氨醇磷酸酯和miRNA-146a的水平升高,前者可能介导了OF内纤维化相关指标的升高[10],而后者在TGF-β诱导的纤维化过程中发挥了负性调节的作用[11]。此外,Fang等[12]研究发现,IL-17A可以促进TGF-β诱导的CD90+ OF纤维化,同时抑制CD90 OF的脂肪化。

我们的前期研究已经证实PTX3与TAO发病高度相关[4-5],而PTX3与组织重构纤维化之间的紧密联系也被越来越多的研究所证实,如Hung等[13]发现PTX3可以通过激活JNK信号通路调节上皮间质转化诱导细胞迁移,参与肾小管间质纤维化;Pilling等[14]发现PTX3广泛分布于特发性肺纤维化患者的肺组织中,同时促进人外周血中单核细胞来源的纤维细胞分化。有趣的是,目前在TAO的研究中发展出一个新的观点,该观点认为外周血中CD34+纤维细胞有可能通过血液循环到达眼眶,并分化成眼眶中CD34+ OF,参与TAO的发病[15]。上述发现说明PTX3很可能参与了TAO纤维化的病理过程。考虑到TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中PTX3表达较高[4],我们选择在培养液中加入rhPTX3,模拟OF在TAO患者眼眶中的高水平PTX3环境,观察TGF-β1的纤维化效应是否发生改变。细胞免疫荧光实验结果表明,rhPTX3对TGF-β1诱导的纤维化没有明显的抑制效应。qRT-PCR结果中α-SMA mRNA表达量发生改变,进一步证明rhPTX3不影响α-SMA表达,却可以与TGF-β1协同上调α-SMA的表达,符合PTX3促进纤维化的假设。令人费解的是,ColIα1并未表现出与α-SMA同样的特征,rhPTX3、TGF-β1或是两者共同刺激均可上调其表达,但3组的调节幅度间差异无统计学意义。由于论证手段的局限性,以上结果仅能在一定程度上提示PTX3可能会促进TGF-β1诱导OF纤维化,还需要更多针对OF的功能学实验证明PTX3含量改变对OF表型的影响。

此外,IL-6作为一个传统的内生性致热原和炎性因子,近期在纤维化疾病的领域中得到了关注。Papiris等[16]研究了特发性肺纤维化患者血液样本,发现存在IL-6增高的特征。无独有偶,在2020年的一项研究中发现,特发性肺纤维化患者来源的人肺成纤维细胞中IL-6受体表达较高,IL-6可以激活细胞内TGF-β信号通路相关蛋白[17]。然而,在TAO发病机制的研究中,IL-6的升高仅仅被认为是TSH受体激活、CD40-CD154诱导、前炎性因子刺激的结果,并参与TAO眼眶炎症环境的延续和B淋巴细胞的成熟[18],其在纤维化中的作用及其与TGF-β之间的关系尚未见研究报道。本研究首次发现TGF-β1可以上调OF中IL-6表达,且PTX3蛋白对该诱导效应有协同作用,能大幅度上调IL-6的表达。PTX3最初是作为一种急性期炎症蛋白被发现的,IL-6可以诱导其他2种穿透素的生成,却对PTX3的表达没有明显作用[19]。本研究发现OF中PTX3对IL-6表达具有上调作用,即PTX3、TGF-β和IL-6三者的相互作用可能是TAO眼眶中炎症和纤维化进程交联的关键环节,该作用为TAO发病机制的研究提供了新的思路,也为临床提供了潜在的治疗靶点。

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