甲状腺相关眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是成人最常见的眼眶病之一,与甲状腺自身免疫异常密切相关[1]。眼外肌功能障碍导致的视物重影是TAO较为常见的临床表现之一,对患者生活质量影响较大,通常发生于疾病后期及眼眶减压术后[2]。TAO的发病机制尚不明确,就目前研究结果来看,眼眶成纤维细胞(orbital fibroblast,OF)是患者眼眶内病理改变的基础,TGF-β诱导的OF纤维化也是患者视物重影的主要原因[3]。
在以往的研究中,我们发现穿透素3(pentraxin 3,PTX3)作为一种体液免疫中的模式识别分子,在TAO患者眼眶脂肪结缔组织及血液中高表达[4],同时促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)可以诱导OF表达PTX3[5],因此我们认为PTX3与TAO的发病高度相关。研究发现PTX3参与人体皮肤创伤修复、特发性肺纤维化及肾间质纤维化等多个病理生理过程[6-7],但PTX3在TAO后期纤维化中的作用尚未见报道。本研究拟应用人重组PTX3(human recombinant PTX3,rhPTX3)蛋白和重组TGF-β1刺激体外培养的OF,探索PTX3对TGF-β1诱导的OF纤维化过程的影响。
1 材料和方法 1.1 样本收集本研究所纳入的TAO患者来源OF取自2018年7月至2019年2月在我科行眼眶减压术的TAO患者,共3例3眼,女2例、男1例,年龄27~45岁,均按照欧洲Graves眼病专家组(European Group on Graves’ Orbitopathy,EUGOGO)标准[8]确诊TAO,患者术前甲状腺功能稳定6个月以上,眼部情况稳定6个月以上,无放射治疗史,未行大剂量糖皮质激素冲击治疗或停用6个月以上。健康来源OF取自2018年8月至2019年1月在我科行上睑下垂矫正术及眼袋整形术的患者,共3例3眼,女2例、男1例,年龄29~34岁,排除自身免疫性疾病及其他眼病,根据患者病情于术中取得脱出眶隔的脂肪结缔组织标本。本研究经海军军医大学(第二军医大学)生物医学伦理委员会审批,患者及家属签署知情同意书后获取相关标本。
1.2 试剂和仪器DMEM高糖培养液、FBS及0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液购自美国Gibco公司,青霉素-链霉素溶液(100×)购自上海碧云天生物技术有限公司,TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司,无水乙醇及甲醇购自上海国药集团,TB Green® Premix Ex TaqTM和PrimeScriptTM RT Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司,人重组TGF-β1购自美国Peprotech公司,rhPTX3蛋白和重组α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体购自英国Abcam公司。
低温超速离心机(德国Hettich公司),超净工作台和CO2恒温培养箱(美国Thermo公司),倒置相差显微镜(日本Nikon公司),ABI 7900HT荧光定量PCR仪和普通PCR仪(美国ABI公司),荧光分光光度计(美国NanoDrop公司)。
1.3 OF培养手术中取下眼眶脂肪结缔组织标本后,于无菌条件下迅速转移至盛有含20% FBS和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM高糖培养液的离心管中。将离心管置入冰水混合物中,快速转运(1 h内)至细胞房超净台(超净台经紫外线消毒30 min)。采用经典组织块培养法培养细胞并传代,第4~10代OF用于后续实验。
1.4 实验分组用含1% FBS的培养液饥饿处理细胞12 h后,分别将TAO患者来源OF和健康来源OF分为4组:空白组加入完全培养液处理细胞;rhPTX3组加入含1 μg/mL rhPTX3的完全培养液处理细胞;TGF-β1组加入含10 ng/mL TGF-β1的完全培养液处理细胞;rhPTX3+TGF-β1组加入含1 μg/mL rhPTX3和10 ng/mL TGF-β1的完全培养液处理细胞。
1.5 细胞免疫荧光实验按照实验分组将OF以每孔3×104个细胞的密度接种到96孔细胞培养板中,并置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱孵育至细胞贴壁融合生长。细胞处理完成后,吸弃原有培养液后加入100 μL甲醇,置于-20 ℃进行细胞固定。用0.1% Triton X-100(PBS配制)溶液完成细胞透化后,封闭非特异性抗原位点。室温下依次孵育特异性一抗及二抗,DAPI染核后于荧光显微镜下观察。
1.6 qRT-PCR采用TRIzol法提取细胞总RNA,经PrimeScriptTM RT Master Mix反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA后,应用TB Green® Premix Ex TaqTM试剂盒配制反应体系,384孔板加样离心混匀后进行PCR反应,用SDS 2.4软件分析目的基因相对表达量。具体实验方法见各试剂盒说明书。该部分实验所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成,具体序列如下:α-SMA上游引物5′-GGT GAT GGT GGG AAT GGG-3′,下游引物5′-GCA GGG TGG GAT GCT CTT-3′;GAPDH上游引物5′-TTG CCA TCA ATG ACC CCT A-3′,下游引物5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3′;Ⅰ型胶原蛋白α1(collagen typeⅠα1,ColIα1)上游引物5′-GAG GGC CAA GAC GAA GAC ATC-3′,下游引物5′-CAG ATC ACG TCA TCG CAC AAC-3′;IL-6上游引物5′-ACT CAC CTC TTC AGA ACG AAT TG-3′,下游引物5′-CCA TCT TTG GAA GGT TCA GGT TG-3′。
1.7 统计学处理采用GraphPad Prism 7.04软件绘图,SPSS 21.0软件进行统计学分析。数据以x±s表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。检验标准(α)为0.05。
2 结果 2.1 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的OF分化的影响细胞免疫荧光实验结束(图 1)显示,OF培养5 d后,空白组中OF均为纺锤形、低荧光的正常成纤维细胞形态;rhPTX3组OF细胞形态及α-SMA蛋白表达未发生明显变化;TGF-β1组OF形态明显改变,α-SMA蛋白强阳性、表达增加,说明其已分化为肌成纤维细胞并发生纤维化;rhPTX3+TGF-β1组与TGF-β1组相比没有明显改变,且TAO患者来源OF和健康来源OF对TGF-β1和rhPTX3的反应无明显差异。
2.2 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的ColIα1和α-SMA mRNA表达的影响
结果如图 2A所示,TGF-β1上调OF内α-SMA mRNA的表达量(相当于对照组的7.97±0.69倍,P<0.01),rhPTX3本身对α-SMA mRNA的表达无明显影响,但与TGF-β1共处理OF可增强TGF-β1对α-SMA的诱导作用,α-SMA mRNA的表达量上升(相当于对照组的18.43±1.23倍,P<0.01);rhPTX3对ColIα1 mRNA的表达并没有表现出类似的效应(图 2B),rhPTX3、TGF-β1及两者共同刺激均可上调ColIα1 mRNA表达(分别相当于对照组的3.27±0.35、2.69±0.32、3.24±0.18倍,与对照组比较P<0.01),但3组间差异无统计学意义。
2.3 rhPTX3蛋白对TGF-β1诱导的IL-6 mRNA表达的影响
TGF-β1和rhPTX3均上调OF内IL-6 mRNA的表达量,分别相当于对照组的93.33±19.22倍和121.25±18.81倍(P均<0.01)。rhPTX3与TGF-β1共处理OF组IL-6 mRNA表达的上调幅度远远超过两者单独作用的诱导效应之和,相当于对照组的549.32±59.69倍(P<0.01)。见图 3。
3 讨论
自20世纪90年代研究者发现TGF-β可以诱导OF产生黏多糖并发生纤维化改变[9]以来,对TAO发病过程中纤维化的探索均围绕这一病理过程展开。近年有研究发现TGF-β1可以诱导TAO患者来源OF中鞘氨醇磷酸酯和miRNA-146a的水平升高,前者可能介导了OF内纤维化相关指标的升高[10],而后者在TGF-β诱导的纤维化过程中发挥了负性调节的作用[11]。此外,Fang等[12]研究发现,IL-17A可以促进TGF-β诱导的CD90+ OF纤维化,同时抑制CD90- OF的脂肪化。
我们的前期研究已经证实PTX3与TAO发病高度相关[4-5],而PTX3与组织重构纤维化之间的紧密联系也被越来越多的研究所证实,如Hung等[13]发现PTX3可以通过激活JNK信号通路调节上皮间质转化诱导细胞迁移,参与肾小管间质纤维化;Pilling等[14]发现PTX3广泛分布于特发性肺纤维化患者的肺组织中,同时促进人外周血中单核细胞来源的纤维细胞分化。有趣的是,目前在TAO的研究中发展出一个新的观点,该观点认为外周血中CD34+纤维细胞有可能通过血液循环到达眼眶,并分化成眼眶中CD34+ OF,参与TAO的发病[15]。上述发现说明PTX3很可能参与了TAO纤维化的病理过程。考虑到TAO患者来源的眼眶脂肪结缔组织中PTX3表达较高[4],我们选择在培养液中加入rhPTX3,模拟OF在TAO患者眼眶中的高水平PTX3环境,观察TGF-β1的纤维化效应是否发生改变。细胞免疫荧光实验结果表明,rhPTX3对TGF-β1诱导的纤维化没有明显的抑制效应。qRT-PCR结果中α-SMA mRNA表达量发生改变,进一步证明rhPTX3不影响α-SMA表达,却可以与TGF-β1协同上调α-SMA的表达,符合PTX3促进纤维化的假设。令人费解的是,ColIα1并未表现出与α-SMA同样的特征,rhPTX3、TGF-β1或是两者共同刺激均可上调其表达,但3组的调节幅度间差异无统计学意义。由于论证手段的局限性,以上结果仅能在一定程度上提示PTX3可能会促进TGF-β1诱导OF纤维化,还需要更多针对OF的功能学实验证明PTX3含量改变对OF表型的影响。
此外,IL-6作为一个传统的内生性致热原和炎性因子,近期在纤维化疾病的领域中得到了关注。Papiris等[16]研究了特发性肺纤维化患者血液样本,发现存在IL-6增高的特征。无独有偶,在2020年的一项研究中发现,特发性肺纤维化患者来源的人肺成纤维细胞中IL-6受体表达较高,IL-6可以激活细胞内TGF-β信号通路相关蛋白[17]。然而,在TAO发病机制的研究中,IL-6的升高仅仅被认为是TSH受体激活、CD40-CD154诱导、前炎性因子刺激的结果,并参与TAO眼眶炎症环境的延续和B淋巴细胞的成熟[18],其在纤维化中的作用及其与TGF-β之间的关系尚未见研究报道。本研究首次发现TGF-β1可以上调OF中IL-6表达,且PTX3蛋白对该诱导效应有协同作用,能大幅度上调IL-6的表达。PTX3最初是作为一种急性期炎症蛋白被发现的,IL-6可以诱导其他2种穿透素的生成,却对PTX3的表达没有明显作用[19]。本研究发现OF中PTX3对IL-6表达具有上调作用,即PTX3、TGF-β和IL-6三者的相互作用可能是TAO眼眶中炎症和纤维化进程交联的关键环节,该作用为TAO发病机制的研究提供了新的思路,也为临床提供了潜在的治疗靶点。
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