第二军医大学学报  2020, Vol. 41 Issue (2): 161-166   PDF    
小分子化合物I942对黑素细胞黑素合成的促进作用
陈雅楠, 吴建华     
海军军医大学(第二军医大学)长海医院皮肤科, 上海 200433
摘要: 目的 研究小分子化合物I942对黑素细胞黑素合成的作用及相关机制。方法 采用多巴染色法对正常人永生化黑素细胞系PIG1进行鉴定,用不同浓度的小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1。用CCK-8法检测小分子化合物I942对细胞活力的影响,用氢氧化钠裂解法检测细胞中黑素含量,用多巴氧化反应法检测细胞中酪氨酸酶活性,用qRT-PCR检测细胞中黑素合成相关蛋白小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)mRNA的表达量,用蛋白质印迹法检测TYR、TRP2的蛋白表达情况。结果 在0~50 μmol/L的浓度范围内,小分子化合物I942对黑素细胞PIG1细胞活力的影响差异无统计学意义(P>0.05)。小分子化合物I942可增加黑素细胞PIG1中黑素含量(P < 0.01),升高细胞内酪氨酸酶活性(P < 0.01)。使用小分子化合物I942处理后,黑素细胞PIG1中MITFTYRTRP1TRP2 mRNA表达均上升(P < 0.01,P < 0.05),TYR、TRP2蛋白表达无明显变化。结论 小分子化合物I942在对细胞活力无明显抑制作用的基础上,可通过升高酪氨酸酶活性增加黑素细胞PIG1中黑素含量,同时黑素合成相关蛋白MITFTYRTRP1TRP2的mRNA表达也升高。
关键词: 白癜风    黑素细胞    黑素合成    cAMP激活的交换蛋白    
Promoting effect of small molecule compound I942 on melanogenesis in melanocytes
CHEN Ya-nan, WU Jian-hua     
Department of Dermatology, Changhai Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
Abstract: Objective To explore the effect of small molecule compound I942 on melanogenesis in melanocytes and the possible mechanism. Methods Dopa staining was used to identify the PIG1 normal human immortal melanocyte cell line. PIG1 melanocytes were treated with different concentrations of small molecule compound I942. The effect of small molecule compound I942 on the cell viability of PIG1 melanocytes was detected by CCK-8 assay. The content of melanin was determined by sodium hydroxide solubilization. The activity of tyrosinase was detected by dopa oxidation. The mRNA expression of melanin synthesis-related proteins (smicrophthalmia-associated transcription factor[MITF], tyrosinase[TYR], tyrosinase-related protein 1[TRP1] and tyrosinase-related protein 2[TRP2]) were detected by qRT-PCR. The protein expression of TYR and TRP2 was detected by Western blotting. Results There were no significant differences in the effect of small molecule compound I942 on the cell viability of PIG1 melanocytes at the concentration ranging from 0 μmol/L to 50 μmol/L. Small molecule compound I942 was found to increase both melanin content and tyrosinase activity in PIG1 melanocytes (both P < 0.01). The mRNA levels of MITF, TYR, TRP1 and TRP2 were also increased after being treated with small molecule compound I942 (P < 0.01, P < 0.05). There were no significant changes in the expression of TYR or TRP2 protein. Conclusion Small molecule compound I942 can increase the melanin content of PIG1 melanocytes by increasing the tyrosinase activity with no obvious inhibition of cell viability. The mRNA expression of melanin synthesis-related proteins (MITF, TYR, TRP1 and TRP2) are also increased.
Key words: vitiligo    melanocyte    melanogenesis    exchange protein activated by cAMP    

白癜风是由表皮黑素细胞减少或功能障碍引起的获得性色素脱失性皮肤病,其确切机制尚不清楚,目前研究较成熟的机制有自身免疫、氧化应激等[1]。白癜风严重影响患者的社会生活及心理健康[2]。黑素合成是黑素细胞的重要功能,皮肤黑素细胞合成黑素是皮肤光保护及色素性疾病发生的重要环节,促进皮肤黑素合成在白癜风治疗中具有重要意义。目前已知黑素合成主要受cAMP/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、Wnt及MAPK等信号通路调节[3-5],其中每条通路又与其他信号通路存在交叉。cAMP激活的交换蛋白(exchange protein activated by cAMP,EPAC)是20世纪90年代发现的与腺体分泌、细胞间黏附、伤口愈合、炎症、纤维化及肿瘤细胞迁移相关的明星蛋白[6-9],其功能还在持续更新中。近年研究发现,EPAC上游接受cAMP的激活,下游与MAPK家族的多个成员相联系[10],更有研究者将其比作cAMP通路与MAPK通路之间的桥梁[11]。我们推测EPAC或许与黑素细胞黑素合成过程有关。小分子化合物I942属于非环状核苷酸类EPAC1激动剂,其结构如图 1所示。我们前期研究表明,小分子化合物I942可通过cAMP/EPAC通路对皮肤细胞发挥作用,如促进成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、IL-6及角质细胞角蛋白19的分泌并促进角质细胞迁移等(未发表资料),然而小分子化合物I942能否通过EPAC通路对黑素细胞产生作用尚未见报道。本研究中,我们在得出小分子化合物I942不影响正常人永生化黑素细胞系PIG1细胞活力的基础上,评估了小分子化合物I942对黑素细胞PIG1黑素含量及酪氨酸酶活性的影响,并对相关分子机制及信号通路进行了初步探索。

图 1 小分子化合物I942化学结构式及化学性质 Fig 1 Chemical structural formula and chemical properties of small molecule compound I942 DMSO: Dimethyl sulfoxide

1 材料和方法 1.1 主要试剂与仪器

DMEM培养液(美国Gibco公司),FBS(美国Gibco公司),0.25%胰酶、多聚多巴(美国Sigma公司),反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、荧光定量PCR仪(日本TaKaRa公司),RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司),PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司],兔抗人酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)抗体、兔抗人酪氨酸酶相关蛋白(tyrosinase-related protein,TRP)2抗体(英国Abcam公司),GAPDH内参蛋白(美国Santa Cruz公司),倒置显微镜(日本Olympus公司),CO2培养箱(日本Sanyo公司),SDS-PAGE垂直电泳仪(美国BioRad公司),人永生化黑素细胞系PIG1(苏州北纳创联生物技术有限公司)。小分子化合物I942由海军军医大学(第二军医大学)长海医院心胸外科陆方林教授友情赠送。

1.2 实验方法 1.2.1 黑素细胞系PIG1的体外培养及鉴定

采用含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养液在37 ℃、5% CO2条件下培养细胞,用多巴染色法进行黑素细胞鉴定。取对数生长期细胞接种于6孔板,在37 ℃、5% CO2条件下孵育48 h,用适量PBS洗涤细胞3次,每次10 min。每孔加入2 mL 0.1%多巴溶液,37 ℃恒温孵育,分别于1、2、3、4 h观察细胞染色情况,拍照并记录。

1.2.2 CCK-8细胞凋亡实验

取对数生长期的黑素细胞PIG1用0.25%胰酶消化约1 min后用含10% FBS的DMEM培养液中止消化,计数后调整细胞密度为1×104/mL,将细胞悬液接种于96孔板,每孔200 μL,每组设3个复孔。过夜后,分别加入浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L的小分子化合物I942于培养液中并在培养箱内培养24、48、72 h。实验结束前4 h向每孔加入19 μL CCK-8试剂,继续培养3~4 h后用酶联免疫检测仪测定各组450 nm波长处的光密度(D)值。

1.2.3 黑素细胞PIG1中黑素含量测定

采用氢氧化钠裂解法检测细胞中黑素合成情况,具体方法参考文献[12]中的方法并加以改良。取对数生长期细胞,用0.25%胰酶消化1 min后用含10% FBS的DMEM培养液终止消化,调整细胞密度为1×105/mL,然后将细胞悬液接种于6孔板,每孔2 mL。在37 ℃、5% CO2条件下孵育8 h后,分别换用含5 μmol/L和10 μmol/L小分子化合物I942的培养液继续培养48 h,吸净培养液并用0.25%胰酶消化1~2 min,终止消化后将细胞悬液转移至EP管中。1 420×g离心5 min,小心吸出上清液,每组加入500 μL 1 mol/L NaOH溶液(含10% DMSO)重悬溶解细胞,37 ℃水浴1 h后用酶联免疫检测仪测定各组450 nm波长处的D值。黑素相对含量(%)=(加药组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。

1.2.4 黑素细胞PIG1中酪氨酸酶活性测定

采用多巴氧化反应法测定细胞中酪氨酸酶活性,具体方法参考文献[13]中的方法并加以改良。取对数生长期细胞,用0.25%胰酶消化1 min后用含10% FBS的DMEM培养液终止消化,调整细胞密度为1×105/mL,然后将细胞悬液接种于6孔板,每孔2 mL。在37 ℃、5% CO2条件下孵育8 h后,分别换用含5 μmol/L和10 μmol/L小分子化合物I942的培养液继续培养48 h,之后吸净培养液并用0.25%胰酶消化1 min,终止消化后将细胞悬液转移至EP管并离心。1 420×g离心5 min,小心吸出上清液,每组加入450 μL 1% Triton X-100溶液重悬后,快速将细胞放入-80 ℃冰箱,30 min后取出置于室温下裂解细胞,加入50 μL 0.1%多巴溶液,37 ℃水浴2 h后用酶联免疫检测仪测定各组490 nm波长处的D值。酪氨酸酶相对活性(%)=(加药组D值-空白组D值)/(对照组D值-空白组D值)×100%。

1.2.5 qRT-PCR

根据黑素含量与酪氨酸酶活性测定结果,选取浓度为5 μmol/L的小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1。采用qRT-PCR检测细胞中黑素合成相关蛋白mRNA的表达,相关引物序列:β-actin上游引物5′-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3′,下游引物5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′;小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)上游引物5′-TCC GTC TCT CAC TGG ATT GGT G-3′, 下游引物5′-CGT GAA TGT GTG TTC ATG CCT GG-3′;TYR上游引物:5′-CGA GCC TGT GCC TCC TCT AA-3′,下游引物:5′-CCA GGA CTC ACG GTC ATC CA-3′;TRP1上游引物5′-TCA TCT ATT CCT GAA TGG AAC AGG-3′,下游引物5′-AAT GAG TGC AAC CAG TAA CAA AGC-3′;TRP2上游引物5′-TCC GCT AGC CAT GGG CTT GTG GGA TGG GG-3′,下游引物5′-ACC GTC GAC TGG TAG GCT TCC TCC GTG TAT-3′。以β-actin为内参,用2-ΔΔCt法分析目的基因的相对表达水平。

1.2.6 蛋白质印迹分析

用强效RIPA裂解液裂解细胞并提取蛋白质,用BCA法检测并调整蛋白浓度后加入上样缓冲液,煮沸10 min备用。每孔加入20 μL蛋白样品,行SDS-PAGE后转至PVDF膜,PBST洗膜3次后,一抗孵育过夜,洗膜后再与HRP标记的兔源或鼠源二抗在室温下孵育1 h,使用电化学发光技术检测相应抗体。

1.3 统计学处理

应用Excel软件进行统计学分析,并用GraphPad Prism 8.0软件内部统计学功能对结果进行验证。所有数据均以x±s表示,组间比较采用独立样本t检验,所有实验至少重复3次。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 黑素细胞PIG1鉴定结果

正常培养条件下,细胞呈梭形或多角形贴壁生长,细胞内可见少量浅色颗粒(图 2A)。在培养液中加入0.1%多巴溶液后,细胞逐渐呈现棕色至黑色,并且随着时间的延长细胞色素逐渐加深(图 2B),证实培养出的细胞为黑素细胞。

图 2 黑素细胞PIG1的鉴定结果 Fig 2 Identification of PIG1 melanocytes A: PIG1 melanocytes without dopa staining; B: PIG1 melanocytes with dopa staining. Original magnification: ×20

2.2 不同浓度小分子化合物I942对黑素细胞PIG1活力的影响

CCK-8细胞凋亡实验结果(图 3)显示,加入不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25、50 μmol/L)小分子化合物I942后黑素细胞PIG1的细胞活力随着培养时间的延长而上升,但不同浓度小分子化合物I942对细胞活力的影响差异无统计学意义,说明在0~50 μmol/L范围内,小分子化合物I942作用于黑素细胞PIG1进行后续研究是安全的。

图 3 不同浓度小分子化合物I942对黑素细胞PIG1细胞活力的影响 Fig 3 Effect of small molecule compound I942 at different concentrations on cell viability of PIG1 melanocytes n=3, x±s

2.3 不同浓度小分子化合物I942对黑素细胞PIG1中黑素含量的影响

分别用0、5、10 μmol/L小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1,氢氧化钠裂解法检测结果显示,与0 μmol/L时相比,5 μmol/L小分子化合物I942处理的黑素细胞PIG1中黑素含量升高了68.7%(1.68±0.08 vs 1.00±0.05,P<0.01),而10 μmol/L小分子化合物I942处理的黑素细胞PIG1中黑素含量升高了22.3%(1.22±0.05 vs 1.00±0.05,P<0.01),结果表明5 μmol/L小分子化合物I942的作用效果更明显。

2.4 不同浓度小分子化合物I942对黑素细胞PIG1中酪氨酸酶活性的影响

分别用0、5、10 μmol/L小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1,多巴氧化反应法检测结果显示,与0 μmol/L时相比,5 μmol/L小分子化合物I942处理的黑素细胞PIG1中酪氨酸酶活性升高了53.0%(1.51±0.09 vs 0.99±0.04,P<0.01),而10 μmol/L小分子化合物I942处理的黑素细胞PIG1中酪氨酸酶活性升高了36.3%(1.35±0.05 vs 0.99±0.04,P<0.01),结果表明5 μmol/L小分子化合物I942的作用效果更明显。

2.5 小分子化合物I942对黑素合成相关蛋白mRNA表达的影响

qRT-PCR结果显示,用5 μmol/L小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1后,细胞中MITFP<0.01)、TYRP<0.05)、TRP1P<0.05)、TRP2P<0.05)mRNA表达均升高(图 4A~4D)。蛋白质印迹分析结果显示,用5 μmol/L小分子化合物I942处理黑素细胞PIG1后,细胞中TYR、TRP2蛋白表达水平均无明显变化(图 4E)。

图 4 小分子化合物I942对黑素细胞中黑素合成相关蛋白表达的影响 Fig 4 Effect of small molecule compound I942 on expression of melanin synthesis-related proteins in PIG1 melanocytes A-D: mRNA expression of MITF, TYR, TRP1 and TRP2 detected by qRT-PCR, respectively (*P < 0.05, **P < 0.01. n=3, x±s); E: Protein expression of TYR and TRP2 detected by Western blotting. MITF: Microphthalmia-associated transcription factor; TYR: Tyrosinase; TRP: Tyrosinase-related protein; qRT-PCR: Quantitative real-time polymerase chain reaction; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

3 讨论

黑素合成是黑素细胞特有的生物学功能,在皮肤的光保护过程中发挥着重要作用,然而异常的黑色素减少或脱失对个体容貌和皮肤健康均会产生不可忽视的影响。促进黑素细胞黑素合成、缓解局部的色素脱失或色素减退对色素减退性皮肤病的治疗及美容医学具有重要意义。在真核生物中,黑素合成是一个复杂的受多条信号通路调节的过程,MAPK通路是黑素合成过程中的重要调节通路,在紫外线暴露后黑素细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)成分增多,进而通过MAPK信号通路促进黑素合成[14-15]。EPAC是cAMP下游除了PKA之外的另一个效应蛋白,具有鸟苷酸交换因子活性,其被cAMP激活后进一步通过Rap1和Rap2发挥作用[16]。EPAC在腺体分泌、细胞间黏附、伤口愈合、炎症、纤维化及肿瘤细胞迁移方面发挥作用[6-9],近年研究发现EPAC还与心肌电生理、炎症性疼痛有关[17-18]。小分子化合物I942能够选择性激动EPAC1蛋白,较目前已上市的相关EPAC通路激动剂特异性高。我们先前的研究发现,小分子化合物I942可通过cAMP/EPAC通路对多种皮肤细胞发挥作用(未发表资料),然而目前尚无小分子化合物I942对正常黑素细胞黑素合成功能的研究。

酪氨酸酶是黑素合成相关蛋白中的重要一员,其催化黑素合成过程中的多个反应,如L-酪氨酸的羟化、左旋多巴的脱氢反应等,是黑素合成的关键酶[19]。本研究证明,小分子化合物I942可在不影响细胞活力的同时增加黑素细胞PIG1中酪氨酸酶活性,从而进一步增加细胞黑素含量。然而小分子化合物I942增强酪氨酸酶活性的机制目前尚不清楚。加入5 μmol/L和10 μmol/L小分子化合物I942均能使黑素细胞中酪氨酸酶活性升高,然而前者效能优于后者,这可能是由于高剂量小分子化合物I942对后续小分子化合物I942与EPAC蛋白的结合产生了负反馈作用,进而下调了小分子化合物I942对酪氨酸酶的激活作用,高剂量小分子化合物I942是否会抑制黑素合成,还需进一步实验验证。MITF通过调节TYR、TRP1、TRP2等黑素合成相关蛋白的转录,在黑素合成调控中起着至关重要的作用[20]。qRT-PCR结果显示,加入小分子化合物I942后MITF mRNA水平与TYRTRP1TRP2的mRNA水平均升高,且MITF变化与其余三者相平行,初步说明小分子化合物I942除直接增强酪氨酸酶活性外,还可通过调节MITF水平进一步调控其下游TYR、TRP1、TRP2等的表达来增加细胞内黑素含量。本研究证明,小分子化合物I942可在黑素细胞PIG1中发挥作用,说明EPAC1在黑素细胞中也有表达,这扩充了EPAC1的表达范围。然而,EPAC1是通过何种途径调控MITF的表达,并对黑素合成产生影响?如前所述,MAPK是调节黑素合成信号通路的重要组成部分,且已有研究证明cAMP可通过EPAC激活p38 MAPK[21],而p38 MAPK磷酸化后可促进MITF基因的表达,进而通过TYR、TRP1等的表达促进黑素合成[22],这是上述现象发生的可能机制之一。与qRT-PCR结果不同,蛋白质印迹分析结果显示加入小分子化合物I942后TYR、TRP2蛋白水平未有明显上升,说明小分子化合物I942对黑素合成的调节方式并非通过增加相关蛋白的表达量实现,而可能与某些转录后翻译前的作用因素有关,如减轻酪氨酸酶调节亚基相关氨基酸残基的磷酸化程度、抑制酪氨酸酶的降解[23]及加速黑素小体成熟[24]等方式升高细胞内黑素含量,具体机制需进一步实验验证。

综上所述,本研究证明小分子化合物I942可在不影响黑素细胞PIG1活力的情况下,增加细胞内酪氨酸酶活性,进而增加细胞黑素含量,进一步确定了小分子化合物I942促进黑素合成的最适浓度。本研究还初步阐明了可能的机制——通过MITF影响TYR等黑素合成相关蛋白调节黑素合成过程,在对EPAC1蛋白的表达范围进行扩充的同时,也为白癜风等色素脱失性疾病的治疗提供了一定的理论支持。然而,EPAC蛋白与黑素合成之间的联系及p38 MAPK是否参与了小分子化合物I942的调节过程还需要深入研究。

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