钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）指各种原因引起的、以主动脉瓣钙化为主要病理改变的疾病。CAVD好发于老年人，随着各国人口老龄化程度加剧，其发病率正逐年增加^[1]。CAVD发生过程涉及内皮损伤、脂质浸润、慢性炎症、基质重塑、纤维化、细胞分化、进展性钙化及新生血管形成等复杂变化^[2-6]，其病理改变早期与动脉粥样硬化相似、晚期与骨形成类似^[7]。在晚期的进展性钙化过程中，骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）起着重要作用。研究发现，BMP-2可受miRNA-141调控^{[3, 8-9]}，但miRNA-141调控BMP-2诱导主动脉瓣钙化的具体机制尚不明确。本研究通过人钙化主动脉瓣检测、人主动脉瓣膜间质细胞（human aortic valve interstitial cell，HAVIC）实验及主动脉瓣钙化小鼠模型实验，探讨miRNA-141通过靶向作用远端缺失同源盒5（distal-less homeobox 5，Dlx5）基因，继而调控BMP-2蛋白诱导的人主动脉瓣钙化的可能机制。

收集2018年9月至2019年3月在海军军医大学（第二军医大学）长征医院接受主动脉瓣膜置换术的24例CAVD患者的退行性主动脉瓣膜，并通过尸检获得24例正常人主动脉瓣膜。标本使用经海军军医大学（第二军医大学）伦理委员会审批，患者家属均已签署知情同意书。

瓣膜经冷PBS清洗、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，刮擦瓣膜内皮细胞层，再将瓣膜剪成3 mm×3 mm大小薄片，置于Ⅱ型胶原酶溶液中，37 ℃培养箱孵育2 h。滤去瓣膜残渣，移入离心管，377.3×g离心5 min，取沉淀。加入1 mL高糖DMEM培养液，混匀，移入培养皿，常规培养，2 d后换液。细胞生长铺满培养瓶底80%左右时传代，每2 d换液1次。选用培养第3~4代细胞进行研究。空白对照组（Con）以标准培养液培养1周；实验组以含10 mmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C和10 mmol/L β-甘油磷酸钠（美国Sigma公司）的钙化培养液进行钙化诱导培养1周，并进一步分为单纯钙化培养液组（Cal）、阴性对照组（miR-NC）、miRNA-141模拟组（M-miR-141）和miRNA-141抑制组（I-miR-141），每组5个样本。

选取雄性Dlx5^-/-ApoE^-/-小鼠45只、雄性Dlx5^+/+ApoE^-/-小鼠45只[SPF级，海军军医大学（第二军医大学）动物实验中心，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0003]，给予0.2%高胆固醇、高脂饮食喂养24周，构建主动脉瓣钙化小鼠模型，并分为空白对照组（Con）、miRNA-141下调（miR-141^-）组和miRNA-141上调（miR-141⁺）组，每组15只。培养3个月后以颈椎脱臼法处死小鼠，收集小鼠主动脉瓣组织。

采用miRNA反转录试剂盒进行反转录，利用特异引物进行qRT-PCR检测。反应条件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 34 s，共40个循环。miRNA-141的表达以U6为内参，Dlx5、BMP-2的表达以β-actin为内参，基因的相对表达量采用2^-ΔΔCt法进行分析。引物序列：U6上游引物5'-CGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，下游引物5'-GAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'；miRNA-141引物5'-GCAGTGTTGGATGGTTGAAGTATG-3'；β-actin上游引物5'- AGGCTGTGTTGTCCCTGTA-3'，下游引物5'-ATGTCACGCACGATTTCC-3'；Dlx5上游引物5'- GCAAGATCACTAGACGGGAATCA-3'，下游引物5'-GCATTGTCGAAGTCGGATACAGAG-3'；BMP-2上游引物5'-TCATAAAACCTGCAACAGCC-AACTCG-3'，下游引物5'-GCTGTACTAGCGAC-ACCCAC-3'。

使用RIPA裂解液（美国Thermo Fisher公司）裂解细胞并提取细胞总蛋白，将蛋白质样品进行凝胶电泳后转膜、封闭，再分别加入工作浓度为1:1 000的一抗（BMP-2抗体，英国Abcam公司；Dlx5抗体，美国Abgent公司）和工作浓度为1:5 000的二抗（辣根过氧化物酶标记的兔源抗体，美国Cell Signaling Technology公司）进行免疫反应。反应完成后使用ECL工作液（美国Thermo Fisher公司）显色，观察目的蛋白的表达情况。以β-actin为内参。

选用50 nmol/L的miRNA-141模拟物、miRNA-141抑制物及阴性对照，以DharmaFect转染试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）转染单层HAVIC培养物（细胞密度为7.5×10⁴/cm²）；用生长培养液（含有10% FBS的DMEM）进一步培养转染后细胞24 h。

使用Von Kossa试剂盒（美国Polysciences公司）对细胞及组织进行Von Kossa染色，并进行半定量分析。细胞染色后，综合考虑染色强度和阳性百分比，采用染色指数法计算钙化得分。（1）染色阳性细胞标记指数计分：随机计数500个细胞（高倍镜下），根据标记指数（labeling index，LI；阳性细胞数目所占百分比）分4个等级，完全无着色为0分，LI＜25%为1分，LI在25%~50%之间为2分，LI＞50%为3分。（2）细胞着色强度计分：按细胞染色后着色的深浅程度计0~3分，与背景色基本一致、细胞没有着色计0分，着色为浅黄色计1分，着色呈棕色计2分，着色为棕褐色计3分。以LI计分和着色强度计分的乘积作为最终得分。

应用TargetScan 6.2软件检索miRNA-141靶基因，结果显示Dlx5基因可能是其潜在靶基因。收集第3~4代HAVIC细胞，按每孔1×10⁶个细胞接种于6孔板，利用PCR法获取HAVIC细胞中的cDNA模板，构建包含miRNA-141结合位点的Dlx5基因3'-UTR序列，插入pGL3-basic荧光素酶质粒中，形成报告基因质粒，所有构建获得的表达质粒经酶切和测序鉴定。按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行操作，将上述重组质粒载体和miRNA-141模拟物、miRNA-141模拟物阴性对照（美国Invitrogen公司）共转染HAVIC 24 h后行双荧光素酶报告基因检测。以荧光素为底物，检测萤火虫荧光素酶活性；加入Stop & Glo试剂（美国Promega公司）检测海肾荧光素酶活性，并以其作为内参照；同时加入抑制荧光素酶催化荧光素发光物质。计算各组细胞内的相对荧光素酶活性。荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。实验操作重复2次。

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，以最小显著性差异法进行两两比较。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。检验水准（α）为0.05。

退行性主动脉瓣膜组24例患者中男14例（58.3%），女10例（41.7%），平均年龄（63.7±4.6）岁；正常主动脉瓣膜组24例中男13例（54.2%）、女11例（45.8%），平均年龄（66.8±6.1）岁；两组间性别比例、平均年龄的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。qRT-PCR及蛋白质印迹法检测结果显示，与正常瓣膜组织相比，钙化主动脉瓣组织中miRNA-141的表达水平降低（1.00±0.02 vs 0.35±0.06，P=0.01）、BMP-2 mRNA表达水平增高（1.00±0.01 vs 1.72±0.12，P=0.01）、BMP-2蛋白的表达水平增高（1.00±0.01 vs 2.14±0.17，P=0.01，图 1）。

图 1 正常主动脉瓣及退行性钙化性主动脉瓣中BMP-2蛋白表达水平 Fig 1 Expression of BMP-2 protein in normal aortic valve and degenerative calcification aortic valve BMP-2: Bone morphogenetic protein-2

Con组、Cal组、miR-NC组、M-miR-141组和I-miR-141组细胞的钙化得分分别为1.00±0.05、1.54±0.13、1.50±0.14、1.35±0.14、1.96±0.15，与Con组相比，4个实验组的细胞钙化得分均升高（P均＜0.05）；Cal组与miR-NC组细胞钙化得分差异无统计学意义（P=0.12）；M-miR-141组较Cal组、I-miR-141组降低（P=0.02，P=0.01）；I-miR-141组较Cal组升高（P=0.01）。

Con组、Cal组、miR-NC组、M-miR-141组和I-miR-141组细胞中Dlx5 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.02、0.96±0.02、0.97±0.02、0.76±0.14、1.89±0.16；Con组、Cal组、miR-NC组Dlx5 mRNA表达差异均无统计学意义（P均＞0.05）；与Con组比较，M-miR-141组的Dlx5 mRNA表达水平降低（P=0.02），而I-miR-141组Dlx5 mRNA表达水平升高（P=0.01），I-miR-141组Dlx5 mRNA表达水平较M-miR-141组升高（P=0.01）。

Con组、Cal组、miR-NC组、M-miR-141组和I-miR-141组细胞中BMP-2蛋白相对表达水平分别为1.00±0.02、0.97±0.02、0.99±0.02、0.71±0.10、1.99±0.16；Con组、Cal组、miR-NC组BMP-2蛋白表达水平差异均无统计学意义（P均＞0.05）；与Con组比较，M-miR-141组的BMP-2蛋白表达水平降低（P=0.02），而I-miR-141组BMP-2蛋白表达水平升高（P=0.01）；I-miR-141组BMP-2蛋白表达水平较M-miR-141组升高（P=0.01）。见图 2。

图 2 各组原代人主动脉瓣膜间质细胞中BMP-2蛋白表达水平 Fig 2 Expression level of BMP-2 protein in human aortic valve interstitial cells of each group BMP-2: Bone morphogenetic protein-2; Con: Control group; Cal: Calcification group; miR-NC: Negative control group; M-miR-141: miRNA-141 mimic group; I-miR-141: miRNA-141 inhibitor group

与阴性对照（pGL3-2空载体）相比，应用miRNA-141模拟物和pGL3-3′ UTR转染细胞后重组质粒的荧光素酶活性降低（0.90±0.04 vs 0.50±0.09，P=0.02），提示miRNA-141通过与Dlx5的3'UTR相互作用并抑制其表达，验证了Dlx5为miRNA-141的靶基因。

Von Kossa染色显示，Con组、miR-141^-组及miR-141⁺组小鼠主动脉瓣膜钙化得分分别为1.00±0.02、1.89±0.10及0.62±0.10，miR-141^-组钙化得分较Con组增高（P=0.01），miR-141⁺组钙化得分较Con组降低（P=0.01）。Con组、miR-141^-组及miR-141⁺组Dlx5 mRNA表达分水平别为1.00±0.08、1.98±0.27及0.54±0.07，BMP-2 mRNA表达水平分别为1.00±0.19、1.83±0.23及0.43±0.16，miR-141-组Dlx5和BMP-2 mRNA表达水平较Con组均升高（P均＜0.05），而miR-141⁺组Dlx5和BMP-2的mRNA表达水平较Con组均降低（P均＜0.05）。Con组、miR-141^-组及miR-141⁺组Dlx5蛋白表达水平分别为1.00±0.09、1.94±0.21及0.40±0.11，BMP-2蛋白表达水平分别为1.00±0.11、1.90±0.19及0.36±0.07；与Con组相比，miR-141-组Dlx5和BMP-2蛋白表达水平均升高（P均＜0.05），而miR-141⁺组Dlx5和BMP-2蛋白表达水平均降低（P均＜0.05）。见图 3。

图 3 各组小鼠主动脉瓣中Dlx5及BMP-2蛋白表达水平 Fig 3 Expression level of Dlx5 and BMP-2 protein in aortic valve in each group Dlx5: Distal-less homeobox 5; BMP-2: Bone morphogenetic protein-2; Con: Control group; miR-141-: miRNA-141 downregulated group; miR-141+: miRNA-141 up-regulated group

将Dlx5基因敲除的主动脉瓣钙化小鼠模型进行同样的分组及培养，结果显示Con组、miR-141^-组、miR-141⁺组BMP-2蛋白表达水平分别为1.00±0.04、0.97±0.03、1.02±0.03（图 4），钙化得分分别为1.00±0.05、0.98±0.04、1.03±0.03，各组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

图 4 各组Dlx5基因敲除小鼠主动脉瓣中BMP-2蛋白表达水平 Fig 4 Expression level of BMP-2 protein in aortic valve in each Dlx5 knockout mouse group Dlx5: Distal-less homeobox 5; BMP-2: Bone morphogenetic protein-2; Con: Control group; miR-141-: miRNA-141 downregulated group; miRNA-141+: miR-141 up-regulated group

许多基因通路参与了心脏瓣膜钙化过程，如胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）通路、BMP-2通路等^[10-11]。已知经典通路中，BMP-2受到Dlx5的调节，激活一系列下游蛋白并与其他非经典途径共同诱发钙化发生，如Laxman等^[9]发现miRNA-203和miRNA-320b通过抑制Dlx5负调控BMP-2诱导的成骨细胞分化，而Dlx5同时抑制下游成骨转录因子Runx2和Osx，共同抑制成骨细胞分化。

miRNA是真核生物中一类内源性的具有调控功能的RNA，可在转录后水平特异性识别靶基因的3'UTR上相应靶点并通过碱基互补配对方式与之结合，从而抑制或加速降解特定靶基因而发挥作用。研究表明，HAVIC高表达或特异表达的miRNA参与调控心脏重构^[12]、瓣膜纤维化^[13]、瓣膜钙化^[14]等多种心脏生理和病理过程。

miRNA-141是miRNA-200家族成员，在成骨及钙化过程中发挥重要调节作用。Yanagawa等^[3]发现先天性二叶瓣畸形患者主动脉标本中miRNA-141的表达降低，而BMP-2的表达增高。Itoh等^[8]发现在小鼠成骨前细胞系中，miRNA-141通过抑制Dlx5调节BMP-2诱导的前成骨细胞分化。但目前尚无研究阐明miRNA-141通过BMP-2通路调控主动脉瓣钙化的具体机制。

本研究发现，与正常主动脉瓣膜组织相比，人退行性钙化主动脉瓣膜组织中miRNA-141的表达降低，而BMP-2的mRNA及蛋白表达水平增高；在HAVIC中，miRNA-141发挥抑制细胞钙化作用，且Dlx5、BMP-2表达水平与miRNA-141表达水平呈负向关系。双荧光素酶报告基因实验显示Dlx5是miRNA-141的直接靶标；在体水平上调miRNA-141表达可降低小鼠主动脉瓣钙化程度并减少BMP-2表达，下调miRNA-141可起到相反作用；而上/下调miRNA-141对Dlx5基因敲除小鼠主动脉瓣钙化及BMP-2蛋白表达无影响。

CAVD作为一种受遗传与环境因素双重影响、涉及复杂细胞分子学机制的慢性进展性疾病，其确切发病机制尚不明确，目前尚无有效的药物可以预防或延缓其进展，因此接受手术或介入瓣膜置换是晚期CAVD患者唯一的选择。本研究首次证实了miRNA-141通过作用于Dlx5抑制BMP-2诱导主动脉瓣钙化的机制，或可为CAVD患者尤其是晚期患者的靶向治疗提供理论依据和新的治疗靶点。