肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是常见的机会性致病菌，是引起社区获得性感染和医院获得性感染的重要病原菌之一，可引发肠外感染，包括呼吸道感染、尿路感染、肝脓肿、内源性眼内炎、手术部位软组织感染和血流感染等，严重者可危及生命^[1-2]。随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，临床上耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的检出率不断增加，2018年中国细菌耐药监测网数据显示CRKP检出率高达26.3%^[3]，给公共卫生和临床抗感染治疗带来严峻挑战。本研究回顾性分析了我院2019年1月至12月CRKP的临床分布、耐药性和分子生物学特征，以期为指导临床合理使用抗菌药物、防控CRKP院内传播提供依据。

收集2019年1月至12月我院临床分离的CRKP菌株。入选标准：药物敏感试验结果显示至少对美罗培南、亚胺培南、厄他培南中的1种药物耐药。利用WHONET 5.6软件进行统计学分析，剔除同一患者同一部位分离的重复菌株。本研究通过我院伦理委员会审批。

采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）和Microflex飞行时间质谱仪（德国布鲁克公司）对分离菌株进行鉴定。采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪对菌株进行体外药物敏感试验，用纸片扩散法（Kirby-Bauer法，纸片购自英国Oxoid公司）进行药物敏感补充试验，试验结果严格参照美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）M100-S29标准^[4]判读。质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）和铜绿假单胞菌（ATCC27853），均由上海市临床检验中心提供。

采用多重PCR技术检测相关耐药基因，其中碳青霉烯酶金属酶耐药基因包括新德里金属β-内酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）、亚胺培南酶（imipenemase，IMP）、维罗纳整合子编码金属β-内酰胺酶（Verona integron-encoded metallo-β-lactamase，VIM）、圣保罗金属β-内酰胺酶（Sao Paulo metallo-β-lactmase，SPM），非金属酶耐药基因包括肺炎克雷伯杆菌碳青霉烯酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）、BIC、苯唑西林酶48（oxacillinase-48，OXA-48）。采用加热煮沸法获取细菌DNA：挑取1~2个新鲜菌落至含0.5 mL灭菌双蒸水的1.5 mL离心管中，震荡混匀后将离心管置于100 ℃沸水浴中煮10 min，然后放入4 ℃冰箱冷却，待离心管内液体冷却后以11 000×g离心5 min，然后吸取上清液至1.5 mL灭菌离心管中，－20 ℃冰箱保存备用。引物序列和具体PCR体系参照文献[5]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成，PCR所需试剂购自日本TaKaRa公司。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s循环30次，72 ℃ 7 min。扩增结束后吸取5 μL扩增产物与1 μL上样缓冲液混匀，进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。阳性扩增产物由上海凌恩生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank数据库比对以证实扩增产物为目的基因片段。

应用拉丝试验（string test）检测CRKP高黏表型。将CRKP接种于5%血琼脂平板，35 ℃孵育过夜，次日用一次性接种环挑取新鲜单个菌落，形成的黏液丝长度＞5 mm定义为拉丝试验阳性。

采用多重PCR技术检测相关基因的表达，CRKP荚膜多糖基因包括K1、K2、K5、K20、K47、K54、K57、K64，毒力基因包括黏液表型调节基因A（regulator of mucoid phenotype A，rmp A）、rmpA2、铁载体中气杆菌素受体基因（ferric aerobactin receptor，iutA）、铁载体中沙门菌素受体基因（siderophore salmochelin receptor，iroN）。引物序列参照文献[6]，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成，PCR所需试剂购自日本TaKaRa公司。细菌DNA模板制备、PCR条件、琼脂糖凝胶电泳等操作均同1.3项。阳性扩增产物由上海凌恩生物科技有限公司测序，测序结果与GenBank数据库比对以证实扩增产物为目的基因片段。

应用WHONET 5.6软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，计数资料以菌株数和百分数表示。

2019年1月至12月，我院共检出肺炎克雷伯菌532株，其中CRKP 140株（26.3%）。CRKP来源于140例患者，其中男性患者101株（72.1%），来源于50岁以上患者99株（70.7%）。患者年龄为14~91岁，平均年龄为（57.7±16.5）岁。男性患者平均年龄为（56.2±16.9）岁，女性患者平均年龄为（61.4±14.9）岁。

140株CRKP主要分离自痰/支气管肺泡灌洗液（66株，47.1%），其次为中段尿（21株，15.0%），分离自血液13株（9.3%）、分泌物12株（8.6%）、引流液11株（7.9%）、静脉导管4株（2.9%）、胆汁2株（1.4%）及其他标本11株（7.9%）。

ICU检出CRKP最多（65株，46.4%），包括心血管外科ICU 47株（33.6%）和烧伤科ICU 18株（12.9%）；其次为急诊科（18株，12.9%）、呼吸科病区（9株，6.4%）、消化科病区（9株，6.4%）、心血管科病区（6株，4.3%）、神经内科病区（6株，4.3%）、泌尿外科门诊（5株，3.6%）、器官移植科（3株，2.1%）和其他科室（19株，13.6%）。

抗菌药物敏感试验结果显示，CRKP对大多数抗菌药物有较高的耐药率，对第1~4代头孢菌素类抗生素的耐药率均在85%以上，对碳青霉烯类药物（厄他培南、亚胺培南、美罗培南）的耐药率最高可达100.0%，仅对替加环素的耐药率较低（＜10%）。见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 CRKP对抗菌药物的耐药率和敏感率 Tab 1 Resistant and sensitive rates of CRKP to antimicrobial agents  n(%) Antibacterial agent N Drug-resistant Drug-sensitive Cefoperazone/sulbactam 140 138 (98.6) 1 (0.7) Ampicillin/sulbactam 140 140 (100.0) 0 Piperacillin/tazobactam 140 132 (94.3) 2 (1.4) Cefazolin 140 140 (100.0) 0 Cefuroxime 139 139 (100.0) 0 Ceftazidime 140 139 (99.3) 1 (0.7) Ceftriaxone 140 138 (98.6) 2 (1.4) Cefepime 140 136 (97.1) 3 (2.1) Cefotetan 131 117 (89.3) 8 (6.1) Cefoxitin 122 122 (100.0) 0 Aztreonam 140 138 (98.6) 2 (1.4) Ertapenem 140 140 (100.0) 0 Imipenem 140 125 (89.3) 10 (7.1) Meropenem 133 125 (94.0) 3 (2.3) Amikacin 134 83 (61.9) 51 (38.1) Gentamicin 140 104 (74.3) 33 (23.6) Tobramycin 140 100 (71.4) 32 (22.9) Ciprofloxacin 140 136 (97.1) 2 (1.4) Levofloxacin 140 136 (97.1) 4 (2.9) Compound trimethoprim 140 105 (75.0) 35 (25.0) Fosfomycin 140 73 (52.1) 40 (28.6) Tigecycline 140 13 (9.3) 76 (54.3)       CRKP: Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

表 1 CRKP对抗菌药物的耐药率和敏感率 Tab 1 Resistant and sensitive rates of CRKP to antimicrobial agents

对140株CRKP进行分离培养，去除污染菌株和缺失菌株，最终成功分离培养CRKP 121株。PCR检测碳青霉烯酶耐药基因结果显示，121株CRKP共检出101株（83.5%）携带KPC 1种基因，7株（5.8%）携带OXA-48 1种基因，2株（1.7%）携带NDM 1种基因，1株同时携带KPC和NDM基因，1株同时携带KPC和OXA-48基因；9株未检测出目的耐药基因。挑取部分阳性产物测序，测序结果与GenBank数据库比对证实均为目的耐药基因，其中KPC为KPC-2，NDM为NDM-1。

121株CRKP中15株（12.4%）拉丝试验阳性。荚膜血清型检测结果显示13株为K64型，2株为K47型。毒力基因检测发现14株检测到毒力基因，其中rmpA、rmpA2阳性各14株，iroN阳性10株，iutA阳性9株。见表 2。

表 2 (Tab 2)

表 2 15株拉丝试验阳性CRKP荚膜血清型及毒力基因检测结果 Tab 2 Detection of capsular serotype and virulence genes of 15 string test positive CRKPs ID Genotype String test Capsular serotype Virulence gene rmpA rmpA2 iutA iroN 9K-2 KPC-2 + K64 + + － + 9K-7 Unknown + K64 + + + － 9K-23 KPC-2 + K64 + + － － 9K-29 KPC-2 + K64 + + － － 9K-44 KPC-2 + K64 + + + + 9K-57 KPC-2 + K47 － － － － 9K-62 KPC-2 + K64 + + + + 9K-74 KPC-2 + K64 + + － + 9K-76 KPC-2 + K64 + + + + 9K-78 KPC-2 + K64 + + + + 9K-80 KPC-2 + K64 + + + + 9K-89 KPC-2 + K47 + + － + 9K-100 KPC-2 + K64 + + + + 9K-104 KPC-2 + K64 + + + + 9K-118 KPC-2 + K64 + + + －       CRKP: Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; KPC-2: Klebsiella pneumoniae carbapenemase 2; rmpA: Regulator of mucoid phenotype A; iutA: Ferric aerobactin receptor; iroN: Siderophore salmochelin receptor. “+” indicates positive result; “－” indicates negative result

表 2 15株拉丝试验阳性CRKP荚膜血清型及毒力基因检测结果 Tab 2 Detection of capsular serotype and virulence genes of 15 string test positive CRKPs

近年来随着碳青霉烯类抗菌药物在临床上的大量应用，耐碳青霉烯类病原菌的比例不断增加，2017年WHO将其列为关键（紧急）级别，因此耐碳青霉烯类病原菌已成为全球公共卫生的严重威胁。本研究回顾性分析了2019年我院临床分离的CRKP情况，共检出CRKP 140株，占检出肺炎克雷伯菌总数的26.3%（140/532），较我院2014－2017年的检出率（17.3%）有所升高^[7]。本研究标本主要来源于50岁以上患者（70.7%，99/140）及ICU患者（46.4%，65/140），男性患者居多（72.1%，101/140），分离自呼吸道标本（47.1%，66/140）最多，其次为尿液（15.0%，21/140）、血液（9.3%，13/140）等，与既往报道^[7-9]一致。分析原因可能在于高龄患者通常免疫力低下，容易发生CRKP感染；ICU患者病情危重，呼吸机安置和导尿管留置等侵入性操作较多，且ICU患者住院时间长，长期使用抗菌药物等均增加了CRKP感染的风险^[10-11]。研究表明ICU患者中男性相较于女性更易发生院内感染^[12]，而我院CRKP主要分离自ICU，这可能是导致我院CRKP感染患者中男性居多的原因。今后应重点关注临床ICU患者和高龄患者，并加强环境卫生和医疗器械消毒，重视医护人员无菌操作，从而防止CRKP医源性感染和院内传播。

本研究药物敏感试验结果显示，我院2019年检出的CRKP对临床绝大多数抗菌药物耐药，其中对碳青霉烯类药物厄他培南、美罗培南、亚胺培南的耐药率分别为100.0%、94.0%和89.3%，高于我院2014－2017年的耐药率（分别为82.1%、88.3%、65.5%）^[7]。对第1~4代头孢菌素类抗生素的耐药率均在85%以上，对环丙沙星、左氧氟沙星的耐药率均为97.1%，仅对替加环素相对敏感[敏感率为54.3%（76/140）]。这在很大程度上限制了临床用药选择，长期替加环素单一治疗也会导致细菌耐药^[13]。目前国内外研究表明采用多黏菌素、替加环素和碳青霉烯类为基础的药物联合应用治疗CRKP感染的疗效明显优于单药治疗^[14-16]，对CRKP感染可增做多黏菌素等药物敏感试验。本研究未对多黏菌素的耐药情况进行分析。近年来，多黏菌素因其耐药率低、治疗效果显著等优势已成为临床上治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道屏障^[16]。但研究表明多黏菌素的耐药率有上升趋势^[17-18]，因此防范多黏菌素耐药也至关重要。

CRKP的耐药机制复杂，包括产碳青霉烯酶、产高水平的AmpC酶或超广谱β-内酰胺酶（extended-spectru β-lactamase，ESBL）、外膜蛋白编码基因缺失或突变、药物作用靶点改变和外排泵系统高表达等^[19]，其中最主要的是产碳青霉烯酶^[20]。本研究对临床常见的碳青霉烯酶基因检测发现，83.5%（101/121）的CRKP携带KPC-2 1种基因，这与胡付品等^[3]报道的中国各地区CRKP以KPC-2基因为主的结果一致。检出7株CRKP携带OXA-48 1种基因，占5.8%（7/121），较我院2015－2017年的检出率（43.9%）显著降低^[21]。检出2株CRKP携带NDM-1 1种基因，占1.7%（2/121），其检出率较低的原因是携带NDM基因的耐药细菌主要在中东地区流行，而在中国等国家检出率较低^[22]。本研究另检出同时携带KPC-2和NDM-1基因及同时携带KPC-2和OXA-48基因的CRKP各1株。近年有关于KPC-2和OXA-48基因共存于CRKP的报道^[23]。此外，全基因组测序发现KPC-2和NDM-1基因可分布于不同的质粒中，CRKP可包含多种耐药质粒^[24]。以上研究结果均证实CRKP有多种碳青霉烯酶耐药基因并存情况。本研究中有9株CRKP未检测出目的耐药基因，是因为本研究仅对部分常见的碳青霉烯酶基因进行了检测，这些菌株可能为非产碳青霉烯酶类CRKP，后续实验将进一步完善其他耐药机制检测，如是否产AmpC酶或ESBL、外膜蛋白编码基因是否缺失等。由于KPC、NDM、OXA-48等耐药基因大多存在于质粒等可移动基因元件中，通过质粒或转座子进行菌株间的水平或垂直传播^[22]，这些耐药基因可能具有同源性，后续可通过脉冲场凝胶电泳和多位点序列分型等实验对CRKP进行同源性分析，以便更好地了解菌株的耐药传播机制，减少产碳青霉烯酶菌株的产生及播散，预防院内感染。

本研究发现拉丝试验阳性菌株15株（12.4%，15/121），为高黏表型肺炎克雷伯菌。其中13株为K64荚膜型，2株为K47荚膜型，与既往报道的高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP）多为K1、K2荚膜型的观点^[25]不同。高黏表型与肺炎克雷伯菌高毒力密切相关，临床上通常将拉丝试验阳性的肺炎克雷伯菌菌株定义为hvKP^[26]，但有研究指出，并非所有的hvKP都表现高黏表型，拉丝试验阳性和血清型检测不能作为鉴定hvKP的确切标准^[27]。

目前多认为高黏表型合并检出毒力基因的肺炎克雷伯菌为hvKP。本研究对15株拉丝试验阳性菌株进行常见的毒力基因检测发现有14株检测到毒力基因，其中rmpA、rmpA2、iroN和iutA均有不同比例的表达，说明至少有14株为耐碳青霉烯类高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae，CR-hvKP）。rmpA、rmpA2是高黏表型调节基因，能调控荚膜合成，是形成高黏表型的重要因子^[28]。iroN和iutA是铁载体系统相关基因，铁载体系统被认为是hvKP具有高毒力的重要原因之一。高毒力与高耐药性并存给临床治疗和基础研究带来严峻挑战，Gu等^[29]报道了一起致命性院内CR-hvKP暴发事件。在中国以外的其他地区也有CR-hvKP感染的报道^[30]。因此，CR-hvKP可能成为下一个“超级细菌”，其传播机制和流行特征有待明确。本研究仅初步筛选了CRKP中的CR-hvKP，明确了荚膜血清分型，但这些CR-hvKP的具体形成机制尚不明确，菌株之间是否存在亲缘关系，毒力基因是否存在毒力质粒上，以及毒力质粒是否为pLVPK等，也需进一步研究。

综上所述，了解CRKP耐药分布和分子生物学特征、加强防控CRKP的院内传播具有重要意义。建立完善的细菌耐药检测体系，规范使用抗生素，必要时加做分子生物学检测确定具体耐药基因型，有利于指导临床个体化用药；加强院内消毒及隔离措施，规范医护人员无菌操作，有利于减少和控制CRKP院内交叉感染。