第二军医大学学报  2019, Vol. 40 Issue (9): 963-969   PDF    
引用本文
彭彬, 宋瑜婷, 张雪, 王莹, 曹帆帆, 张登海. 雷公藤红素诱导未折叠蛋白反应信号通路中真核细胞翻译起始因子2α活化抑制多发性骨髓瘤细胞生长[J]. 第二军医大学学报, 2019, 40(9): 963-969  
PENG Bin, SONG Yu-ting, ZHANG Xue, WANG Ying, CAO Fan-fan, ZHANG Deng-hai. Celastrol inhibits multiple myeloma cell growth by activating eukaryotic initiation factor 2α in unfolded protein response[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2019, 40(9): 963-969 (in Chinese with English abstract)  
雷公藤红素诱导未折叠蛋白反应信号通路中真核细胞翻译起始因子2α活化抑制多发性骨髓瘤细胞生长
彭彬1Δ, 宋瑜婷1,2Δ, 张雪1, 王莹1, 曹帆帆1, 张登海1     
1. 海军军医大学(第二军医大学)附属公利医院中心实验室, 上海 200135;
2. 宁夏医科大学研究生院, 银川 750000
收稿日期: 2019-04-17    接受日期: 2019-06-26
基金项目: 上海市浦东新区卫生和计划生育委员会学科带头人项目（PWRd2018-12），海军军医大学（第二军医大学）附属公利医院人才培养计划（GLRb2018-01）.
作者简介: 彭彬, 博士, 副主任技师.E-mail:lily_1001pb@163.com; 宋瑜婷, 硕士生.E-mail:1617210816@qq.com
△共同第一作者
通信作者(Corresponding author): 张登海.Tel:021-58858730, E-mail:shanghai_zhang@hotmail.com
摘要: 目的 研究雷公藤红素抑制多发性骨髓瘤细胞增殖与未折叠蛋白反应（UPR）的关系和分子机制，为多发性骨髓瘤的治疗提供新的药物靶点。方法 4种多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226、U266、SKO、KMS-11，经不同浓度雷公藤红素（增殖实验0.0~10.0 μmol/L、凋亡实验0.0~4.0 μmol/L、周期阻滞实验0.0~1.5 μmol/L）处理不同时间（增殖实验1~3 d、凋亡实验1 d、周期阻滞实验1 d）后，检测细胞增殖、凋亡、周期阻滞情况；用蛋白质印迹法检测肌醇需求酶1（IRE1）、蛋白激酶样内质网激酶（PERK）和活化转录因子6（ATF6）3条UPR信号通路中主要分子的表达，包括葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、ATF6、PERK、真核细胞翻译起始因子2α（eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）、C/EBP同源蛋白（CHOP）、IRE1、磷酸化IRE1（p-IRE1）。用慢病毒包被的含短发夹RNA（shRNA）载体对eIF2α表达进行干扰，观察雷公藤红素对干扰eIF2α表达后的RPMI 8226细胞UPR信号分子表达、凋亡和细胞周期的影响。结果 雷公藤红素以剂量和时间依赖方式抑制4种多发性骨髓瘤细胞增殖、诱导凋亡、使细胞周期阻滞在G0/G1期，其中RPMI 8226细胞对雷公藤红素最敏感。在RPMI 8226细胞，雷公藤红素处理浓度在0.5~2.0 μmol/L作用30 min~24 h时均能使UPR的PERK通路中p-eIF2α表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01），其下游CHOP表达也相应增加（P < 0.05或P < 0.01），而对其他2条通路ATF6和IRE1影响不明显。用慢病毒干扰eIF2α表达后，雷公藤红素上调CHOP表达、诱导凋亡和周期阻滞的作用均减弱或消失。结论 雷公藤红素能抑制多种多发性骨髓瘤细胞增殖，活化UPR的PERK信号通路中eIF2α分子可能是其作用机制之一。
关键词: 雷公藤红素    多发性骨髓瘤    未折叠蛋白反应    真核细胞翻译起始因子2α    
Celastrol inhibits multiple myeloma cell growth by activating eukaryotic initiation factor 2α in unfolded protein response
PENG Bin1Δ, SONG Yu-ting1,2Δ, ZHANG Xue1, WANG Ying1, CAO Fan-fan1, ZHANG Deng-hai1     
1. Central Laboratory, Gongli Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200135, China;
2. Graduate School, Ningxia Medical University, Yinchuan 750000, Ningxia Hui Autonomous Region, China
Supported by Academic Leader Project of Shanghai Pudong New Area Health and Family Planning Commission (PWRd2018-12) and Talent Cultivation Project of Gongli Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University) (GLRb2018-01).
△Co-first authors
Abstract: Objective To investigate the relationship between celastrol inhibition against multiple myeloma cell growth and unfolded protein response (UPR) and the related molecular mechanism, so as to provide new drug targets for multiple myeloma treatment. Methods Four multiple myeloma cell lines RPMI 8226, U266, SKO and KMS-11 were treated with different concentrations (proliferation:0.0-10.0 μmol/L; apoptosis:0.0-4.0 μmol/L; cell cycle:0.0-1.5 μmol/L) of celastrol for different periods (proliferation:1-3 d; apoptosis:1 d; cell cycle:1 d), and cell proliferation, apoptosis and cell cycle were examined. Western blotting analysis was used to detect the main molecules in the inositol-requiring enzyme 1 (IRE1), PRKR-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), and activating transcription factor 6 (ATF6) signaling pathways of UPR, which included glucose-regulated protein 78 (GRP78), ATF6, PERK, eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), phosphorylated-eIF2α (p-eIF2α), C/EBP homologous protein (CHOP), IRE1 and phosphorylated-IRE1 (p-IRE1). After the lentivirus vector containing short hairpin RNA (shRNA) was used to interfere with eIF2α expression in RPMI 8226 cells, the effects of celastrol were detected on signaling molecule expression, apoptosis and cell cycle. Results Celastrol inhibited the proliferation of 4 multiple myeloma cells, induced apoptosis, and arrested the cell cycle at G0/G1 phase in dose- and time-dependent manners. RPMI 8226 cells were most sensitive to celastrol. For RPMI 8226 cells, when 0.5-2.0 μmol/L of celastrol was used for 30 min to 24 h, the p-eIF2α levels in the PERK signaling pathway of UPR were significantly increased (P < 0.05 or P < 0.01), and the downstream CHOP expression was risen correspondingly (P < 0.05 or P < 0.01), but the other two pathways ATF6 and IRE1 were not affected obviously. After interference of eIF2α expression with lentivirus vector containing shRNA, the effects of celastrol to increase CHOP expression, induce apoptosis and arrest cell cycle were significantly attenuated or disappeared. Conclusion Celastrol can inhibit the growth of a variety of multiple myeloma cells, and the activated eIF2α molecule in the UPR PERK signaling pathway may be one of the mechanisms.
Key words: celastrol    multiple myeloma    unfolded protein response    eukaryotic initiation factor 2α    

多发性骨髓瘤（multiple myeloma）是一种难治性、恶性浆细胞病。骨髓瘤细胞含有丰富的内质网，能产生和分泌大量免疫球蛋白，这些免疫球蛋白在经内质网折叠时极易发生错误，从而诱发内质网应激，发生未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。一定程度UPR对维持骨髓瘤细胞内质网稳态和肿瘤细胞存活有重要作用[1]。但过度的UPR将导致肿瘤细胞死亡。因此，靶向激活UPR的药物成为多发性骨髓瘤治疗领域的研究热点。UPR主要通过3条信号通路发挥作用，分别为肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶样内质网激酶（PRKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）通路。

雷公藤红素（celastrol）是从中药雷公藤植物中提取出的一种三萜类化合物，具有多种药理作用，包括抑制炎症[2-3]、抗肿瘤[4-5]、神经元保护[6]等。本研究旨在考察雷公藤红素抑制多发性骨髓瘤细胞增殖是否与UPR信号通路有关，并明确相关分子机制。

1 材料和方法 1.1 实验材料

多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226购自中国科学院上海细胞库，多发性骨髓瘤细胞株U266、SKO、KMS-11由海军军医大学（第二军医大学）长征医院侯健实验室馈赠。雷公藤红素购自美国Sigma公司（纯度≥98%）。

细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中。每2~3 d更换1次新鲜培养液，取对数生长期的细胞用于实验。细胞培养在37 ℃、含5% CO2培养箱中，并保持培养箱相对湿度维持在95%左右。

取一定量雷公藤红素溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中，配制成50 mmol/L的溶液，－20 ℃贮存。处理细胞前，用不含血清和酚红的RPMI 1640培养液将50 mmol/L雷公藤红素稀释至所需浓度。同时将等量DMSO用同样的培养液稀释，作为溶剂对照。

1.2 细胞增殖检测

用本实验室开发的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（5, 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）标记技术检测细胞增殖情况[7]。简言之，先用CFSE标记细胞制成带荧光的细胞微球，收集药物处理后的细胞，加入1×104荧光细胞微球及碘化丙啶（propidium iodide，PI）染料后，上流式细胞仪进行检测。

1.3 细胞凋亡检测

收集药物处理后的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液充分洗涤细胞2次，用结合缓冲液（江苏碧云天生物技术研究所）重悬细胞，取细胞悬液加入Annexin Ⅴ-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）和7-氨基放线菌素（7-amino-actinomycin D，7-AAD）溶液。混匀后室温避光孵育10 min，加入300 μL结合缓冲液，上流式细胞仪进行检测。

1.4 细胞周期检测

药物处理后，收集细胞至流式管中，用70%乙醇固定1 h以上，磷酸盐缓冲液洗3次，加入含RNA酶、PI、Triton的磷酸盐缓冲液中，37℃孵育10 min后，立刻上流式细胞仪进行检测。

1.5 蛋白质印迹法检测

收集处理后的细胞，提取总蛋白。取一定量蛋白上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，转膜，膜与一抗孵育之后，与相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，用ECL进行显色，用化学发光成像系统采集图像。

1.6 短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）载体构建

合成所需引物，sh-eIF2α正义引物5'-CCG GGC ACC TTC ATT TGT TAG ATT AGG ATC CTA ATC TAA CAA ATG AAG GTG CTT TTT G-3'，反义引物5'-AAT TCA AAA AGC ACC TTC ATT TGT TAG ATT AGG ATC CTA ATC TAA CAA ATG AAG GTG C-3'。引物溶解退火后，将片段连入用EcoRⅠ和AgeⅠ双酶切过的pHMGV2-U6-Puro载体中，并将连接产物转入XL10感受态细胞（美国Addgene公司）中，提取质粒，然后测序验证相关位点。

1.7 慢病毒包被shRNA载体及稳转株获得

将验证正确的载体用慢病毒包被后转染至HEK293T细胞（购自中国科学院上海细胞库），经压力筛选后，获得稳定转染shRNA的细胞。

1.8 统计学处理

用SPSS 17.0软件进行数据处理。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析。检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 雷公藤红素抑制多发性骨髓瘤细胞增殖、诱导凋亡并导致细胞周期阻滞在G0/G1期

用雷公藤红素分别处理人多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226、U266、KMS-11、SKO后，发现雷公藤红素能抑制这4种细胞增殖，且随药物浓度增加和处理时间延长抑制效果增强。其中RPMI 8226对雷公藤红素最敏感，1、2、3 d的半抑制浓度（half-inhibitory concentration，IC50）值分别为2.55、1.47、0.67 μmol/L；对雷公藤红素最不敏感的是SKO，1、2、3 d的IC50值分别为4.81、3.83、2.00 μmol/L；U266在1、2、3 d的IC50值分别为2.61、1.98、1.21 μmol/L，KMS-11在1、2、3 d的IC50值分别为3.54、2.73、1.69 μmol/L（图 1）。雷公藤红素浓度为2.0~4.0 μmol/L时，对4种多发性骨髓瘤细胞均能诱导发生凋亡（P＜0.01）；在1 μmol/L时即能诱导RPMI 8226细胞发生凋亡（P＜0.05）。见图 2。雷公藤红素在1.5 μmol/L时导致RPMI 8226和U266细胞周期阻滞在G0/G1期，但对KMS-11和SKO的细胞周期没有明显影响（图 3）。

图 1 雷公藤红素以时间和剂量依赖方式抑制4种多发性骨髓瘤细胞株增殖 Fig 1 Celastrol inhibiting multiple myeloma cell proliferation in time- and dose-dependent ways A: RPMI 8226; B: U266; C: KMS-11; D: SKO. n＝3, x±s

图 2 雷公藤红素以剂量依赖方式诱导4种多发性骨髓瘤细胞株发生凋亡 Fig 2 Celastrol inducing multiple myeloma cell apoptosis in time- and dose-dependent ways After 1 d treated with different concentrations of celastrol, the apoptosis levels of RPMI 8226 (A), U266 (B), KMS-11 (C) and SKO (D) cells were detected by flow cytometry. *P < 0.05, **P < 0.01 vs 0.0 μmol/L celastrol group. n＝3, x±s

图 3 雷公藤红素对4种多发性骨髓瘤细胞株细胞周期的影响 Fig 3 Effect of celastrol on cell cycle of multiple myeloma cells After 1 d treated with different concentrations of celastrol, the cell cycle of RPMI 8226 (A), U266 (B), KMS-11 (C) and SKO (D) cells was detected by flow cytometry

2.2 雷公藤红素对RPMI 8226 UPR信号通路分子表达的影响

RPMI 8226经0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤红素分别处理10 min、30 min、1 h、6 h、24 h后，检测葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、ATF6、PERK、真核细胞翻译起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）、磷酸化eIF2α（p-eIF2α）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、IRE1、磷酸化IRE1（p-IRE1）的表达。结果显示，雷公藤红素主要影响PERK通路，并通过激活p-eIF2α进一步促进下游的CHOP表达，而且这种作用具有剂量和时间依赖性；而对ATF6和IRE1通路没有明显影响（图 4、表 1）。

图 4 雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226 UPR信号通路分子表达的影响

表 1 雷公藤红素处理后多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226 UPR信号通路分子相对表达量 Tab 1 Relative expression of UPR signal pathway molecules in multiple myeloma cell RPMI 8226 after celastrol treatment

2.3 雷公藤红素通过激活eIF2α抑制多发性骨髓瘤细胞生长

为进一步验证eIF2α 活化在雷公藤红素抑制多发性骨髓瘤细胞生长中的作用，本研究通过构建针对eIF2α 的shRNA慢病毒载体，筛选出低表达eIF2α的RPMI 8226稳转株（图 5A）。将低表达eIF2α的RPMI 8226细胞经0.5、1.0、1.5、2.0 μmol/L雷公藤红素分别处理10 min、30 min、1 h、6 h、24 h后检测eIF2α下游CHOP表达，结果显示雷公藤红素上调CHOP表达的作用消失（图 5B~5F）。此外，eIF2α低表达后，雷公藤红素诱导多发性骨髓瘤细胞发生凋亡的能力减弱（图 6），而且不再能使多发性骨髓瘤细胞发生周期阻滞（图 7）。

图 5 干扰eIF2α后雷公藤红素对其下游CHOP分子表达的影响 Fig 5 Effect of celastrol on CHOP expression following interfering eIF2α A: Expression of eIF2α protein in RPMI 8226 cells treated by short hairpin RNA; B-F: Expression of CHOP protein in RPMI 8226 cells interfered with sh-eIF2α and followed by celastrol treatment for 10 min (B), 30 min (C), 1 h (D), 6 h (E) and 24 h (F). eIF2α: Eukaryotic initiation factor 2α; CHOP: C/EBP homologous protein. **P < 0.01 vs scramble group. n＝3, x±s

图 6 干扰eIF2α后不同浓度雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226凋亡的影响 Fig 6 Effect of different concentrations of celastrol on apoptosis of multiple myeloma cell RPMI 8226 following interfering eIF2α A: Scramble; B: sh-eIF2α. eIF2α: Eukaryotic initiation factor 2α; FITC: Fluorescein isothiocyanate; 7-AAD: 7-amino-actinomycin D

图 7 干扰eIF2α后雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞株RPMI 8226细胞周期的影响 Fig 7 Effect of celastrol on cell cycle of multiple myloma cell RPMI 8226 following interfering eIF2α A: Scramble; B: sh-eIF2α. eIF2α: Eukaryotic initiation factor 2α

3 讨论

研究表明，雷公藤红素能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，诱导凋亡[8-9]。本研究同时对多种多发性骨髓瘤细胞株进行研究，也发现雷公藤红素能抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，此外还发现雷公藤红素能使RPMI 8226和U266细胞阻滞在G0/G1期，并与诱导UPR有关。

骨髓瘤细胞内单克隆免疫球蛋白或轻链（M蛋白）过度生成，为维持生存会发生内质网应激，导致UPR，如果内质网应激未能得到缓解，UPR将诱导细胞凋亡[10]。在哺乳动物中，内质网膜上存在3种应激感受蛋白：IRE1、PERK、ATF6。这些跨膜蛋白位于内质网内面的结构域和内质网伴侣分子GRP78相互作用。其中PERK可通过ATF4/ATF3介导的CHOP表达增加诱导凋亡[10-12]。研究发现，雷公藤红素能致头颈癌细胞死亡，这一作用依赖于诱导UPR，其主要通过活化PERK/eIF2α/ATF4/CHOP或IRE1/XBP1通路激活UPR[13]。

本研究对UPR 3条信号通路中的主要分子进行检测，发现雷公藤红素能激活eIF2α并使下游的CHOP表达升高，提示雷公藤红素抑制多发性骨髓瘤细胞增殖可能与该通路有关。本研究还发现通过shRNA干扰技术降低多发性骨髓瘤细胞eIF2α表达后，雷公藤红素上调CHOP表达、诱导凋亡和导致周期阻滞的作用均减弱或消失。证明雷公藤红素主要是通过激活UPR信号通路中PERK途径的eIF2α发挥抗多发性骨髓瘤作用。

本研究为雷公藤红素治疗多发性骨髓瘤提供了新的基础理论依据，提示eIF2α可能是雷公藤红素发挥治疗作用的重要靶点。

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