2019, Vol. 40
长链非编码RNA-H19特异性吸附微RNA-760调控nanog基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移
引用本文
李莎, 朱怡卿, 石荟, 戈霞晖, 许靖, 商艳, 王芳, 白冲. 长链非编码RNA-H19特异性吸附微RNA-760调控nanog基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移[J]. 第二军医大学学报, 2019, 40(8): 854-859 
LI Sha, ZHU Yi-qing, SHI Hui, GE Xia-hui, XU Jing, SHANG Yan, WANG Fang, BAI Chong. Long non-coding RNA-H19 promotes proliferation and migration of non-small cell lung cancer cells through sponging microRNA-760 to regulate nanog gene expression[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2019, 40(8): 854-859 (in Chinese with English abstract)
长链非编码RNA-H19特异性吸附微RNA-760调控nanog基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖和迁移
1. 海军军医大学(第二军医大学)长海医院呼吸与危重症医学科, 上海 200433;
2. 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院医学遗传学教研室, 上海 200433;
3. 上海中医药大学附属第七人民医院呼吸科, 上海 200137
2. 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院医学遗传学教研室, 上海 200433;
3. 上海中医药大学附属第七人民医院呼吸科, 上海 200137
摘要: 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）-H19对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞增殖、迁移的影响及分子机制。方法 收集2015年10月至2016年5月海军军医大学（第二军医大学）长海医院确诊的20例NSCLC患者手术切除的NSCLC组织及相应的癌旁正常组织。通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测NSCLC组织及癌旁正常组织，人NSCLC细胞系A549、NCI-H1299和人正常肺上皮细胞系BEAS-2B中lncRNA-H19的表达。在A549细胞中过表达lncRNA-H19后，采用CCK-8法和Transwell实验分别检测细胞的增殖和迁移能力。利用生物信息学分析预测lncRNA-H19与微RNA（miRNA）-760的结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验分析lncRNA-H19对miRNA-760的吸附作用，采用qPCR和蛋白质印迹法分别检测lncRNA-H19过表达对miRNA-760及下游靶基因nanog表达的影响。通过对A549细胞转染miRNA-760模拟剂过表达miRNA-760后，检测过表达miRNA-760对lncRNA-H19促进NSCLC细胞增殖和迁移作用的影响。结果 LncRNA-H19在NSCLC组织和A549、NCI-H1299细胞中均呈高表达，分别与其在癌旁正常组织和BEAS-2B细胞中的表达水平相比差异均有统计学意义（P均 < 0.01）。与对照组相比，过表达lncRNA-H19后A549细胞的增殖能力增强（P < 0.05）、迁移能力提高（P < 0.01）。在线数据库starBase v3.0预测分析结果显示lncRNA-H19能特异性吸附miRNA-760。双荧光素酶报告基因检测结果显示lncRNA-H19与miRNA-760之间存在特异性结合。与对照组相比，过表达lncRNA-H19可抑制A549细胞中miRNA-760的表达（P均 < 0.05），并促进其下游基因nanog在mRNA和蛋白水平的表达（P均 < 0.01）。过表达miRNA-760可抑制lncRNA-H19对A549细胞增殖和迁移的促进作用，与lncRNA-H19过表达组相比差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。结论 LncRNA-H19可通过特异性吸附miRNA-760调控nanog基因表达，从而促进NSCLC细胞增殖和迁移。
关键词:
非小细胞肺癌 长链非编码RNA-H19 微RNA-760 nanog基因
Long non-coding RNA-H19 promotes proliferation and migration of non-small cell lung cancer cells through sponging microRNA-760 to regulate nanog gene expression
1. Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China;
2. Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China;
3. Department of Respiratory Medicine, Seventh People's Hospital of Shanghai, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China
2. Department of Medical Genetics, College of Basic Medical Sciences, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China;
3. Department of Respiratory Medicine, Seventh People's Hospital of Shanghai, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (81570020, 81300018), Public Welfare Technology Application Research Project of Zhejiang Province (2016C33216), and Science and Technology Development Fund of Pudong New Area (PKJ2016-Y49).
Abstract: Objective To explore the role of long non-coding RNA (lncRNA)-H19 in the proliferation and migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells and the molecular mechanisms. Methods The expressions of lncRNA-H19 in 20 NSCLC tissues and paired non-tumor tissues, which were collected from Changhai Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University) from Oct. 2015 to May 2016, were detected by real-time quantitative PCR (qPCR). We also examined lncRNA-H19 expressions in NSCLC cell lines A549 and NCI-H1299 and normal lung epithelial cell line BEAS-2B by qPCR. The proliferation and migration of A549 cells overexpressing lncRNA-H19 were detected by CCK-8 assay and Transwell assay, respectively. Bioinformatics analysis and duel-luciferase reporter assay were conducted to predict and confirm the interaction between microRNA (miRNA)-760 and lncRNA-H19. Western blotting analysis and RT-qPCR were performed to observe the influence of lncRNA-H19 overexpression on the expression of miRNA-760 and target gene nanog. MiRNA-760 was overexpressed in A549 cells, and its role in lncRNA-H19 promoting proliferation and migration of NSCLC cells was observed. Results The expressions of lncRNA-H19 in NSCLC tissues and A549 and NCI-H1299 cells were significantly upregulated compared with those in normal tissues and BEAS-2B cells (all P < 0.01). Overexpression of lncRNA-H19 significantly improved the proliferation ability (P < 0.05) and migration ability (P < 0.01) of A549 cells compared with the negative control group. The results of starBase v3.0 showed that lncRNA-H19 could specifically adsorb miRNA-760, and duel-luciferase reporter assay showed that lncRNA-H19 directly bound to miRNA-760. Compared with the negative control group, overexpression of lncRNA-H19 significantly inhibited miRNA-760 expression in A549 cells (P < 0.05) and promoted the expression of the downstream gene nanog at mRNA and protein levels (all P < 0.01). Overexpression of miRNA-760 significantly inhibited lncRNA-H19-induced proliferation and migration of A549 cells (all P < 0.05). Conclusion LncRNA-H19 can promote the proliferation and migration of NSCLC cells through sponging miRNA-760 to regulate nanog gene expression.
Key words:
non-small cell lung carcinoma long non-coding RNA-H19 microRNA-760 nanog gene
肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。依据世界卫生组织调查数据，仅在2016年全球就新增约180万例肺癌患者，并超过150万例患者死亡[1]。按照临床病理类型分类，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）两大类，其中NSCLC是最常见的肺癌分型，约占肺癌的85%[2]。2016年的报道显示，虽然外科手术的发展和免疫治疗的出现为肿瘤患者带来了福音，但肺癌预后仍不尽如人意，5年生存率仅约为11%[2]。因此，正确认识肺癌发生、发展过程及分子机制对于肺癌的早期诊断、制定合理的靶向药物治疗方案、提高患者生存率至关重要。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200 nt、不能编码蛋白质的RNA分子[3]。LncRNA-H19是一种被广泛研究的印记基因，具有重要的生物学功能[4]。He等[5]的研究报道，lncRNA-H19可通过竞争性结合let-7调控滋养层细胞的成球黏附，参与子宫内膜修复。在胚胎造血干细胞发育过程中，lncRNA-H19可通过抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性，促进内皮细胞向间质细胞分化[6]。另外，乳腺癌、肝癌及神经胶质瘤等与lncRNA-H19表达异常增加有关[7-9]。然而，目前lncRNA-H19在NSCLC中的表达及其作用鲜见报道。本研究通过检测lncRNA-H19在NSCLC组织和人NSCLC细胞系中的表达，探讨lncRNA-H19在NSCLC发生、发展中的作用和机制。
1 材料和方法 1.1 组织样本收集2015年10月至2016年5月海军军医大学（第二军医大学）长海医院确诊的20例NSCLC患者手术切除的NSCLC组织及相应的癌旁正常组织（距离肿瘤组织≥5 cm），其中男15例、女5例，平均年龄为（39±7）岁，术前均未接受化学治疗。获取组织标本后立即浸入液氮冷冻后保存于-80℃。本研究遵循海军军医大学（第二军医大学）生物医学研究伦理委员会规定并通过审批，患者均知情同意。
1.2 细胞培养与转染人NSCLC细胞系A549、NCI-H1299，人正常肺上皮细胞系BEAS-2B均由中国科学院上海细胞库提供。培养条件：使用含10%胎牛血清及100 µg/mL青霉素、链霉素双抗的DMEM高糖培养液，置于37℃、5% CO2 的培养箱中培养。按照Lipo3000转染试剂说明书进行细胞转染，转染48 h后检测转染效率。
1.3 实验试剂DMEM高糖培养液、胰酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）及胎牛血清均购自美国Gibco公司；引物、lncRNA-H19过表达质粒、微RNA（microRNA，miRNA）-760模拟剂、双荧光质粒均由生工生物工程（上海）股份有限公司代为设计并合成；Lipo3000转染试剂购自美国ThermoFisher公司；RNA抽提、反转录及实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒均购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；CCK-8检测试剂盒购自广州锐博生物技术有限公司；nanog抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），抗体、荧光二抗均购自英国Abcam公司。
1.4 RNA抽提与qPCR检测依据TRIzol试剂说明书提取组织和细胞总RNA，通过反转录获得cDNA，反应体系为10 µL：2 μL 5×反应混合液、1 μL RNA，7 μL H2O；反应条件：37℃ 15 min、85℃ 15 s。以cDNA为模板进行qPCR，反应体系为20 μL：10 μL SYBR，1 μL cDNA，1 μL引物，8 μL H2O；反应条件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 10 min。引物序列：lncRNA-H9上游5′-GGC AAG AAG CGG GTC TGT-3′，下游5′-GTG CAG CAT ATT CAT TTC CAA G-3′；nanog上游5′-TTT GTG GGC CTG AAG AAA ACT-3′，下游5′-AGG GCT GTC CTG AAT AAG CAG-3′；GAPDH上游5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，下游5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。以GAPDH为内参照基因，采用2－ΔΔCt法计算RNA的相对表达量。
1.5 细胞功能学实验 1.5.1 CCK-8法检测细胞增殖取对数生长期A549细胞，稀释至细胞密度为3×104/mL的细胞悬液，并以每孔100 µL接种于96孔板。待细胞贴壁后，分别在培养0、24、48、72、96 h时加入10 µL CCK-8试剂，再培养2 h后用酶标仪检测450 nm处光密度值。
1.5.2 Transwell法检测细胞迁移取对数生长期A549细胞，用无血清培养液稀释至细胞密度为1×105/mL的细胞悬液，取400 µL接种于Transwell小室内，小室外添加400 µL完全培养液。连续培养24 h后取出小室，用预热后的PBS轻轻润洗，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定20 min。再次取出小室，用蒸馏水洗涤后自然晾干，加入结晶紫中染色液染色30 min。洗去结晶紫染液后在显微镜下观察。
1.6 双荧光素酶报告基因实验采用美国Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统，依据实验说明进行操作，计算萤火虫荧光值与海肾荧光值的比值，评估报告基因在细胞中的相对活力。
1.7 蛋白质印迹法用细胞刮收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解，100℃煮沸10 min变性后冰上冷却，然后保存于-20℃。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，取20 µL蛋白质样本进行电泳。转膜后用快速封闭液封闭1 h，加入按1:1 000稀释的nanog抗体、GAPDH抗体稀释液室温孵育2 h，用吐温磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline-Tween，PBST）洗膜3次，再加入二抗稀释液室温孵育1 h，用PBST洗膜3次。用Odyssey近红外扫描仪扫描。
1.8 统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；呈偏态分布的计量资料以中位数表示，两组间比较采用非参数秩和检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 LncRNA-H19在NSCLC组织及细胞中表达增加qPCR检测结果显示，lncRNA-H19在NSCLC组织中的表达高于其在癌旁正常组织中的表达，差异有统计学意义（P＝0.001 1，图 1A）；lncRNA-H19在人NSCLC细胞系A549和NCI-H1299细胞中的表达均高于其在人正常肺上皮细胞系BEAS-2B细胞中的表达，差异均有统计学意义（P均＜0.01，图 1B）。
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图 1 qPCR检测NSCLC组织和细胞系中lncRNA-H19的表达 Fig 1 Expression of lncRNA-H19 in NSCLC tissues and cell lines detected by qPCR A: Relative expression of lncRNA-H19 in NSCLC tissues and nontumor tissues. n＝20. B: Relative expression of lncRNA-H19 in human NSCLC cell lines (A549 and NCI-H1299) and human normal lung cell line (BEAS-2B). **P < 0.01 vs BEAS-2B. n＝3, x±s.>NSCLC: Non-small cell lung cancer; lncRNA: Long non-coding RNA |
2.2 过表达lncRNA-H19促进NSCLC细胞的增殖与迁移
qPCR结果（图 2A）显示，在A549细胞中过表达lncRNA-H19后，细胞中lncRNA-H19表达增加，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），说明过表达细胞模型构建成功。CCK-8实验结果（图 2B）显示，过表达lncRNA-H19可以提高A549细胞的增殖能力，在细胞培养72、96 h时与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。Transwell实验结果（图 2C）显示，过表达lncRNA-H19可以提高A549细胞的迁移能力，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。
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图 2 过表达lncRNA-H19促进人NSCLC细胞系A549的增殖和迁移 Fig 2 Overexpression of lncRNA-H19 improving proliferation and migration of human NSCLC cell line A549 A: Overexpression of lncRNA-H19 was confirmed by qPCR; B: CCK-8 analysis revealed that overexpression of lncRNA-H19 dramatically enhanced the proliferation ability of A549 cells; C: Transwell assay showed that overexpression of lncRNA-H19 dramatically improved the migration ability of A549 cells. lncRNA: Long non-coding RNA; NSCLC: Non-small cell lung cancer; NC: Negative control; OV-H19: Overexpression of lncRNA-H19; CCK-8: Cell counting kit-8. *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC group. n＝3, x±s |
2.3 LncRNA H19特异性吸附miRNA-760并调控其靶基因nanog的表达
在线数据库starBase v3.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）预测分析结果（图 3A）显示，lncRNA-H19能特异性吸附miRNA-760。双荧光素酶报告基因检测结果（图 3B）显示，野生型lncRNA-H19与miRNA-760同时转染细胞后荧光度值下降（P＜0.05），表明lncRNA-H19与miRNA-760之间存在特异性结合。qPCR检测结果（图 3C）显示，过表达lncRNA-H19可抑制A549细胞中miRNA-760的表达，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。qPCR（图 3D）和蛋白质印迹分析检测结果（图 3E）显示，过表达lncRNA-H19促进A549细胞中nanog基因在mRNA和蛋白质水平的表达，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。
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图 3 LncRNA-H19特异性结合miRNA-760并调控miRNA-760和nanog基因的表达 Fig 3 LncRNA-H19 directly bound to miRNA-760 and regulated the expression of miRNA-760 and nanog gene A: The binding sites between lncRNA-H19 and miRNA-760 were predicted by starBase v3.0; B: Duel-luciferase reporter analysis revealed that lncRNA-H19 bound to miRNA-760 specifically; C: qPCR analysis revealed that overexpression of lncRNA-H19 significantly decreased the relative expression of miRNA-760 in human NSCLC cell line A549; D: qPCR analysis revealed that overexpression of lncRNA-H19 significantly decreased the relative mRNA expression of nanog in A549 cells; E: Western blotting analysis revealed that overexpression of lncRNA-H19 significantly decreased the relative protein expression of nanog in A549 cells. lncRNA: Long non-coding RNA; miRNA: microRNA; NSCLC: Non-small cell lung cancer; NC: Negative control; OV-H19: Overexpression of lncRNA-H19; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. *P < 0.05, **P < 0.01 vs miRNA-control in Fig 3B, vs NC in Fig 3C-3E. n＝3, x±s |
2.4 过表达miRNA-760抑制lncRNA-H19对NSCLC细胞增殖和迁移的促进作用
CCK-8实验结果（图 4A）显示，在过表达lncRNA-H19的A549细胞中转染miRNA-760模拟剂后，lncRNA-H19对A549细胞的促增殖作用被抑制，在细胞培养72、96 h时与过表达组相比差异均有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。Transwell实验结果（图 4B）显示，过表达miRNA-760可以抑制lncRNA-H19对A549细胞迁移的促进作用，与lncRNA-H19过表达组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。
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图 4 MiRNA-760模拟剂处理抑制lncRNA-H19对人NSCLC细胞系A549细胞增殖和迁移的促进作用 Fig 4 MiRNA-760 mimic reserved lncRNA-H19-induced proliferation and migration of human NSCLC cell line A549 A: Treatment of miRNA-760 mimic dampened the proliferation ability of A549 cells that was enhanced by overexpression of lncRNA-H19; B: Treatment of miRNA-760 mimic dampened the migration ability of A549 cells that was enhanced by overexpression of lncRNA-H19. miRNA: microRNA; lnRNA: Long non-coding RNA; NSCLC: Non-small cell lung cancer; NC: Negative control; OV-H19: Overexpression of lncRNA-H19. *P < 0.05, **P < 0.01 vs OV-H19+miRNA-760 mimic. n＝3, x±s |
3 讨论
本研究利用qPCR法检测了20对NSCLC组织和相应癌旁正常组织中lncRNA-H19的表达情况，发现lncRNA-H19在癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织；同时，相较人正常肺上皮细胞，人NSCLC细胞系中lncRNA-H19的表达也增加。结果提示lncRNA-H19与NSCLC的发生、发展密切相关。为了进一步明确lncRNA-H19在NSCLC发生、发展过程中的作用，本实验构建了lncRNA-H19过表达的人NSCLC细胞系，并通过CCK-8法和Transwell实验评估lncRNA-H19对NSCLC细胞增殖和迁移的影响，结果显示，lncRNA-H19过表达可以提高人NSCLC细胞的增殖和迁移能力，表明lncRNA-H19对促进NSCLC的发生、发展有重要作用。
竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假说认为，非编码RNA可以通过竞争性结合内源性miRNA，阻断miRNA与其下游靶分子间的相互作用，间接调控mRNA的降解，发挥生物学作用[10]。Wang等[11]研究发现，LINC00336通过特异性吸附miRNA-6852参与胱硫醚β合成酶的调控，从而促进肺癌的发生、发展。相似的，也有报道称lncRNA-PVT1通过竞争性结合miRNA-365参与肝癌的形成[12]。因此，我们推测lncRNA-H19在NSCLC中的促癌作用可能也依赖于ceRNA机制。为了深入探讨lncRNA-H19在NSCLC发生、发展中的作用机制，我们利用生物信息学分析预测lncRNA-H19可能吸附的miRNA。结果显示，lncRNA-H19与抑癌基因miRNA-760[13]之间存在结合位点。双荧光素酶报告基因实验证实，lncRNA-H19确实可以特异性地吸附miRNA-760。进一步qPCR检测和蛋白质印迹实验表明，lncRNA-H19过表达可以降低miRNA-760的表达水平，同时促进miRNA-760下游靶基因nanog的表达。为了证实lncRNA-H19在NSCLC中的促癌作用依赖于其特异性吸附miRNA-760，我们用miRNA-760模拟剂处理过表达lncRNA-H19的A549细胞后，采用CCK-8实验和Transwell实验分别检测细胞的增殖和迁移能力，结果显示，miRNA-760模拟剂可以抑制lncRNA-H19的促增殖作用和促迁移作用。以上实验结果均表明，lncRNA-H19可通过特异性地吸附miRNA-760调控原癌基因nanog的表达，从而促进NSCLC的发生和发展。
综上所述，lncRNA-H19在NSCLC的发生、发展中发挥着重要作用，其可通过特异性吸附miRNA-760调控nanog基因的表达促进NSCLC细胞的增殖和迁移，本研究结论为NSCLC的治疗提供了新的干预靶点。近年来许多研究表明，在肿瘤组织中特异性表达的lncRNA是一种潜在肿瘤标志物，如NSCLC患者血浆中lncRNA-UCA1的表达较正常人增加[14]，而lncRNA-H19在NSCLC患者血浆中的表达水平及其临床意义仍待进一步探究。同时，虽然本研究在细胞水平证实了lncRNA-H19在NSCLC细胞增殖和迁移中的作用，但干扰lncRNA-H19是否可以作为NSCLC的治疗策略仍需通过动物实验进一步明确。
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