2. 上海交通大学附属第一人民医院宝山分院检验科, 上海 200940
2. Department of Clinical Laboratory, Baoshan Branch of Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200940, China
有核红细胞(nucleated red blood cell,NRBC)是未成熟的红细胞,一般仅存在于骨髓中,血液中出现NRBC是由于幼稚的骨髓红系细胞释放入外周血所致。新生儿或幼儿血液中可见NRBC [1],但健康成年人血液中无NRBC,成人外周血涂片中出现NRBC均属病理现象[2]。在某些临床条件下,外周血NRBC的存在与疾病的不良预后有关[3-4]。NRBC通常会与淋巴细胞同时计数,造成白细胞计数假阳性升高,因此准确计数NRBC对于校准白细胞总数非常必要。在临床实验室中,传统的NRBC计数方法是显微镜下人工计数,计数结果通常报告为NRBC百分比,即每100个白细胞中NRBC的数量[5],较为费时、费力。曾有学者尝试使用流式细胞术进行NRBC计数,但精确性不是很高[6]。目前已经开发出精密度和准确度可被接受的自动血液分析仪来检测NRBC水平[7-9]。
Sysmex XN-9000血液分析仪可对外周血中NRBC进行计数,其原理是利用荧光染色对细胞核进行染色,用流式法测定侧向荧光强度(反映细胞核酸含量)和前向散射光强度(反映细胞体积),将其与白细胞、红细胞和血小板区别。为了解Sysmex XN-9000血液分析仪对外周血NRBC计数的准确度及临床应用价值,本研究以显微镜下人工计数为金标准,评价Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC的准确度,并对外周血中NRBC阳性患者的疾病谱进行分析。
1 材料和方法 1.1 标本来源16 273例外周血液标本来源于海军军医大学(第二军医大学)长海医院2016年1月1日至2017年6月15日住院患者。使用EDTA-K2作为抗凝剂收集外周血标本,对每例标本分别进行仪器检测和显微镜下人工检测。其中277例经显微镜下人工检测确定为NRBC阳性,此277例患者中男160例、女117例,年龄为(43.35 ± 19.95)岁。本研究经海军军医大学(第二军医大学)长海医院伦理委员会审批。
1.2 Sysmex XN-9000血液分析仪检测Sysmex XN-9000血液分析仪及其配套试剂、配套质控品均为日本希森美康公司产品。对实验室内血常规仪器严格质量控制,使用Sysmex配套质控品,根据Westgard质控规则[10],在不发生失控的前提下,按Sysmex XN-9000血液分析仪的操作标准以及我科根据ISO 15189 [11]制定的标准作业程序,进行全血细胞计数+白细胞分类DIFF通道检测。残余样品具有足够标本量进行重复测试。所有标本均在采样2 h内进行检测。NRBC计数和NRBC百分比采用Sysmex XN-9000血液分析仪自动计算得出,当仪器检出NRBC绝对计数大于0即为阳性。
1.2.1 批内精密度选取高、中、低值的患者血液标本各1份,在仪器上分别检测11次,并在30 min内完成检测,记录NRBC计数和NRBC百分比,弃去第1次的检测数据,分别计算高、中、低值的变异系数(coefficient of variation,CV),评价仪器的批内精密度。
1.2.2 携带污染率取1份患者血液标本,使用仪器进行多次检测。待测定值达到稳定后,取1份高值标本连续测定3次(结果记录为H1、H2、H3),随后立即取1份低值标本连续测定3次(结果记录为L1、L2、L3),按下述公式计算携带污染率:携带污染率(%)=(L1-L3)/(H3-L3)× 100% [2]。
1.2.3 线性范围取1份高值血液标本,采用仪器稀释液以20%为梯度倍比稀释成6个浓度,血液与稀释液比例分别为0:5、1:4、2:3、3:2、4:1和5:0,分别在仪器上检测,每个浓度标本平行检测2次,取其平均值与相应的理论值比较,并进行线性分析,拟合线性方程Y=aX + b,要求a值在0.95~1.05范围内,R2 ≥ 0.95。
1.3 显微镜下人工检测制作血涂片并进行瑞氏染色,瑞氏染液Ⅰ、Ⅱ购自中国台湾贝索企业有限公司,血涂片的制备、染色、烘干全程由Sysmex-SP10推片机(日本希森美康公司)自动完成。血涂片厚薄适宜,头、体、尾分明,细胞分布均匀,血膜边缘整齐。所制血涂片由2名经验丰富的实验室工作人员(中级职称)在Olympus CX-21光学显微镜(日本奥林巴斯公司)下观察。根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南[5],每名工作人员均在400倍视野下计数每200个白细胞中NRBC的数量,结果报告为NRBC百分比,取2名工作人员计数结果的平均值。计数采用双盲法,即在实验室工作人员未查看过Sysmex XN-9000血液分析仪的结果及彼此讨论计数的情况下,显微镜下查见NRBC即为阳性。
1.4 评价指标收集16 273例外周血标本,分别应用Sysmex XN-9000血液分析仪和显微镜下人工检测两种方法检测NRBC,以显微镜下人工检测结果为金标准,计算仪器检测的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。以两种方法检测均为阳性的248例标本作为研究对象,分析两种方法检测NRBC百分比的相关性,计算不同NRBC水平下仪器检测和人工镜检结果的CV。对Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC计数与校正后白细胞计数、红细胞计数和血红蛋白进行相关性分析。对显微镜下人工检测结果显示NRBC阳性的277例患者的疾病种类进行分析。
1.5 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x ± s表示,两种检测方法所测结果的比较采用配对t检验。不符合正态分布的计量资料以中位数(下四分位数,上四分位数)表示,两种检测方法所测结果的比较采用Wilcoxon秩和检验,血液病各组之间的NRBC计数和NRBC百分比的比较采用Kruskal-Wallis H检验。对两种检测方法所测NRBC百分比进行Spearman秩相关分析。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 仪器性能评估Sysmex XN-9000血液分析仪对低值、中值、高值标本NRBC计数和NRBC百分比的批内精密度好(表 1)。仪器检测NRBC计数与NRBC百分比的携带污染率分别为0.32%、0.25%。选取1份NRBC计数为20.2 × 109 /L的高值血液标本,稀释成6个浓度后分别在仪器上检测,并与理论值进行回归,得到线性回归方程Y=1.004 8 X + 0.011 0(R2=0.992 5)。
2.2 Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC的价值
对16 273例患者的血液标本进行检测, 以显微镜下人工检测结果为金标准, Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC的灵敏度为89.5%, 特异度为99.6%, 阳性预测值为80.5%, 阴性预测值为99.8%, 见表 2。以两种方法检测均为阳性的248例标本为研究对象, 分析两种检测方法所测NRBC百分比的相关性, 结果显示二者呈正相关(rs=0.813, P < 0.001), 见图 1A。根据Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果将248例标本分为NRBC百分比 < 5%和NRBC百分比≥ 5%两组, 分别对两种方法的检测结果进行相关性分析, 结果显示NRBC百分比 < 5%的标本两种方法的检测结果呈正相关(n=172, rs=0.711, P < 0.001), 见图 1B; NRBC百分比≥ 5%的标本两种方法的检测结果亦呈正相关(n=76, rs=0.704, P < 0.001), 见图 1C。将248例标本分为NRBC百分比≤ 1%(75例)、> 1%且≤ 6%(107例)、> 6%且≤ 10%(35例)、> 10%且≤ 20%(19例)和 > 20%(12例)共5组, 计算两种方法检测结果的CV, 结果显示显微镜下人工检测结果的CV为8.53%~53.60%, Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果的CV为6.30%~36.69%。当NRBC百分比处于较低水平(≤ 10%)时, 两种方法检测结果的CV均较高, 且显微镜下人工检测结果的CV高于Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果(图 2)。
2.3 NRBC阳性患者的疾病谱分析
对277例NRBC阳性患者的疾病谱进行分析,其中血液病患者173例,非血液病患者104例。血液病组和非血液病组NRBC计数差异有统计学意义(非血液病组中位数为0.38 × 109 /L,血液病组中位数为0.16 × 109 /L,P<0.05),NRBC百分比差异无统计学意义(非血液病组中位数为2.95%,血液病组中位数为3.60%,P=0.835 1),见图 3。
173例血液病患者中,急性淋巴细胞白血病31例,急性粒细胞白血病55例,淋巴瘤39例,多发性骨髓瘤18例,其他血液病30例。不同血液病患者之间NRBC计数及NRBC百分比差异均无统计学意义(图 4)。104例非血液病患者中,以实体肿瘤(24例,23.1%)和肝硬化上消化道出血(36例,34.6%)占比较高。
3 讨论
早期的自动血液分析仪除了全血细胞计数所需的试剂外,直接对NRBC计数通常还需要用于细胞膜裂解和核染色的特殊试剂,成本较高,并且结果发布时间将会延长。针对此问题,近年来自动血液分析仪进行了相关改进,自动计数NRBC的效率大大提高[12-13]。日本希森美康公司开发的Sysmex XN-9000血液分析仪可在全血细胞计数的同时计数NRBC,并且当确定NRBC阳性时提示校正的白细胞计数[14]。
本研究评估了Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC的性能和准确度,在重复性实验中NRBC计数低值CV为6.4%,中值与高值CV均<5%,表明其检测重复性好。
以两种方法检测均为阳性的248例标本作为研究对象,分析两种方法检测NRBC百分比的相关性,结果显示Sysmex XN-9000血液分析仪与显微镜下人工检测结果的相关性较好。根据Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果将248例标本分为NRBC百分比<5%和NRBC百分比≥ 5%两组,结果显示两组中两种方法的检测结果均呈正相关,其中NRBC百分比≥ 5%组中两种方法检测结果的线性关系较好(rs=0.704)。进一步对不同水平NRBC百分比(≤ 1%、>1%且≤ 6%、>6%且≤ 10%、>10%且≤ 20%和>20%)情况下两种方法检测结果的CV进行分析,发现显微镜下人工检测结果的CV为8.53%~53.60%,Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果的CV为6.30%~36.69%。两种方法检测结果的CV均较高,且显微镜下人工检测结果的CV高于Sysmex XN-9000血液分析仪检测结果。此结果提示当标本中NRBC水平较低时,显微镜下人工检测漏检率增加,而Sysmex XN-9000血液分析仪精确度优于显微镜下人工检测。
本研究对NRBC阳性的277例患者进行疾病谱分析,发现173例为血液病患者,包括急性淋巴细胞白血病31例、急性粒细胞白血病55例、淋巴瘤39例、多发性骨髓瘤18例、其他血液病30例,不同类型血液病之间NRBC计数及百分比差异均无统计学意义;104例为非血液病患者,以实体肿瘤和肝硬化上消化道出血患者为主,其外周血出现NRBC很有可能是由于肿瘤或肝硬化造成的贫血导致骨髓造血功能亢进或脾脏器官清除外周NRBC能力低下导致的。NRBC在血液病与非血液病中的诊断价值正在不断被发掘[15-16],我们后续也将对NRBC的临床意义进行更深入的分析。
综上所述,Sysmex XN-9000血液分析仪检测NRBC计数和百分比的重复性和准确度好,其在计数NRBC方面可以替代传统显微镜下人工计数,尤其在高通量的实验室中对于低值标本可以起到提示作用,以防漏检,为临床诊断和治疗提供可靠依据。
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