钙化性主动瓣疾病（calcific aortic valve disease，CAVD）是一组多种因素参与的、以主动脉瓣钙化纤维化为主要病理改变的疾病。正常的主动脉瓣从解剖学上分为3片瓣叶，各瓣叶在组织学上均可分为3层：主动脉侧的纤维层、中间的松质层及心室侧的心室肌层，3层组织均由成分不同的细胞外基质及种植于其中的瓣膜间质细胞（valve interstitial cell，VIC）组成，而瓣膜最外层则由单层瓣膜内皮细胞（valve endothelial cell，VEC）覆盖。

既往CAVD一直被认为是一种被动的退行性改变，是钙盐伴随年龄增长的沉积使瓣膜退化、硬化的过程；然而近年来的基础研究表明，CAVD涉及内皮损伤、慢性炎症、细胞外基质重塑、细胞表型分化及细胞凋亡等复杂病理变化为一主动过程^[1-3]。CAVD的早期病理改变与动脉粥样硬化相似，可能与内皮细胞损伤及慢性炎症有关，而病变晚期则与骨形成过程相近。目前，主动脉瓣疾病的治疗方式主要是外科手术治疗，费用较高，且瓣膜置换术后长期抗凝治疗对患者的依从性也提出了较大的挑战。因此，探究CAVD的发病机制、从病因学上根治CAVD已成为研究热点。VIC及VEC作为构成瓣膜组织的两类细胞，均可能参与了CAVD的发展。非编码RNA如微RNA（microRNA，miRNA）和长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）主要参与mRNA转录后翻译水平的调节，近年来大量研究表明非编码RNA在CAVD的发生及预后方面起着重要作用，现就非编码RNA在CAVD发生、发展中的作用展开讨论。

VIC是瓣膜组织中最主要的细胞类型，其调控过程主要包括特异性成骨信号通路被激活后介导VIC向成骨细胞分化和细胞凋亡途径激活介导的营养不良性钙化2个方面。

VIC是一类间质细胞，其形态学及功能均介于成纤维细胞及平滑肌细胞之间，具有一定的收缩能力及分泌能力。大量体外实验从组织、细胞和分子水平验证了VIC向成骨样细胞分化的假说。CAVD相关的信号转导通路十分复杂，包括Notch1信号通路、Runx2信号通路、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）/Smad信号通路、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路以及转化生长因子β（transforming growth factor β，TGF-β）信号通路。其中，Notch1可调节其下游基因Runx2 及BMP2 的表达，从而调控瓣膜钙化过程^[4-5]。BMP类似于细胞“命运”决定因子，当VIC开始表达BMP时Smad1、5、8信号通路活化，成骨转录因子Msx2和Runx2的表达上调，促进VIC形成骨组织^[6-7]。

非编码RNA与VIC的激活有关。多种非编码RNA参与了心血管的病理生理过程，但其在CAVD发生、发展过程中的作用研究仍在起步阶段。Wang等^[8]通过基因芯片检测4对CAVD患者瓣膜标本及取自器官捐献供体的正常瓣膜标本，结果提示有92个miRNA出现差异表达。在主动脉瓣狭窄患者标本中，miRNA-204、miRNA-214表达下调，而miRNA-486、miRNA-92a、miRNA-181b、miRNA-125b等表达上调^[9]。其中miRNA-204可能是CAVD的一个保护因子，其能通过抑制Smad4及Runx2的表达抑制VIC向成骨细胞分化^[10-12]。而miR-29b则能激活Wnt/β-catenin信号通路促进瓣膜钙化^[13]。

相比miRNA，目前有关lncRNA在CAVD中的研究相对较少。Wang等^[14]通过转录组分析对比钙化主动脉瓣及32种其他人体组织，发现了725种主动脉瓣特异lncRNA。LncRNA-H19是一种印记基因，主要在胚胎发生过程中高度表达，出生后大多数组织中几乎无法检测到其表达。目前已经证实lncRNA-H19异常表达与肿瘤发生、动脉粥样硬化、心力衰竭及心肌肥厚有关^[15-16]。Hadji等^[17]发现CAVD患者瓣膜中lncRNA-H19表达上调，与之相反的是钙化瓣膜中启动子区甲基化程度较低。lncRNA-H19通过阻止Notch1 基因启动子区P53蛋白的募集沉默Notch1的表达，从而促进瓣膜钙化；敲除VIC中lncRNA-H19后，Notch1表达上调，继而导致Runx2及BMP2表达下调^[18]。Carrion等^[19]发现，主动脉瓣二叶畸形（bicuspid aortic valve，BAV）瓣膜标本中lncRNA-HOTAIR表达下调，因BAV瓣膜承受的压力较三叶式主动脉瓣大，Wnt/β-catenin作为一种张力反应信号通路随即被激活并抑制lncRNA-HOTAIR的表达，从而介导瓣膜钙化。钙化瓣膜中lncRNA-TUG1、lncRNA-MALAT1表达水平上调，其可通过直接结合miRNA-204而抑制其功能，促进其下游Runx2及Smad4的表达，从而促进VIC钙化^{[12, 20]}。

非编码RNA除了参与不同心血管疾病的病理生理过程，还可能作为生物标志物或靶点用于不同疾病的诊断、预后预测及治疗^[21-23]。研究发现，miRNA-92a可能是主动脉瓣钙化的一个潜在生物标志物^[24]。人工合成的miRNA类似物或抑制剂一直被用于miRNA的基础研究，其也可能被用于某些特殊疾病的基因治疗。长期应用miRNA-33抑制剂可减轻低密度脂蛋白受体敲除小鼠动脉粥样硬化的病变程度^[25]，而miRNA-21拮抗剂被用于治疗Alport综合征已经进入Ⅰ期临床试验^[26]。

细胞凋亡是机体调控发育、维护内环境稳定并由基因控制的一种细胞主动死亡过程，又称为程序性细胞死亡。TGF-β1作为一种经典的促进血管平滑肌细胞钙化的细胞因子，其在钙化瓣膜中表达上调，并能通过激活凋亡信号通路促进瓣膜钙化^[27]。TGF-β1在细胞凋亡期间可以释放基质小泡和微粒，例如凋亡小体，其能富集钙盐并使磷酸钙晶体成核导致营养不良性钙化^[28-30]。Jan等^[31]报道，miRNA-214可能通过调控线粒体凋亡相关蛋白参与瓣膜性心脏病，但具体机制尚不清楚。Zhang等^[32]则发现，miRNA-30b可能通过抑制caspase-3的表达从而抑制VIC钙化。

VEC覆盖于瓣膜的外表面，直接接触血流。血流动力学及炎症改变能够直接作用于VEC，其作为一个探测器可感受外界的变化，然后通过调节基底膜的渗透性、炎症细胞黏附能力转导外界的信号变化，维持瓣膜内环境的稳定。因此，VEC在CAVD的发生过程中可能扮演着始动角色^[33]。VEC参与CAVD的分子机制可能包括2个方面：VEC发生内皮间质转化（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）成为具有增殖能力的VIC；VEC旁分泌机制发生变化，影响VIC的形态学或者功能。

EndMT是涉及多种发育和病理事件的关键生物学过程，其特征在于细胞与细胞的接触逐渐丧失、细胞极性改变、肌动蛋白细胞骨架重排产生的基底层切割和侵入，导致丝状伪足形成，并最终导致间质基因表达进行性上调。心脏在胚胎发育过程中需要经历2次EndMT形成原始心脏，此后，在房室交界处和心室流出道的位置又通过EndMT形成原始瓣膜并逐渐发育为成熟瓣膜^[34-35]。VEC在TGF-β、机械应力、炎症介质等刺激下可发生EndMT，使VEC失去原有的内皮细胞表型并获得间质表型，表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。Mahler等^[36]通过体外流体冲刷模拟血流剪切力发现，在稳定的血流剪切力下，即使该力较大，其EndMT相关基因和炎症相关基因表达仍较低；当VEC暴露于不稳定的剪切力下，EndMT相关基因和炎性相关基因表达上调，伴VEC侵袭力增强。非编码RNA可参与EndMT过程。Geng和Guan^[37]发现miRNA-18a-5p可通过抑制Notch2途径抑制EndMT。LncRNA-MALAT1首先于肿瘤中被报道，后来发现其能通过miRNA-145调节TGF-β1诱导的EndMT过程^[38]。

血流剪切力作用于VEC，使其形态、基因表达发生相应变化，BAV的瓣叶承受的机械应力更高，内皮细胞更容易受损。既往研究表明BAV是导致主动脉瓣钙化狭窄的重要危险因素之一，BAV人群行主动脉瓣置换治疗的终身风险约为50%，其发生CAVD的发病率也高于正常人群，BAV比正常主动脉瓣早10~20年发生钙化^[39-40]。BAV钙化瓣膜中，miRNA-26a、miRNA-30b和miRNA-195的表达分别降低了65%、62%、59%，其改变可能与瓣膜钙化有关^[41]。部分对血流敏感的miRNA如miRNA-10a、miRNA-19a、miRNA-23b等可能参与了内皮失调及动脉粥样硬化的发展过程^[42]。LncRNA-MALAT1可能通过调节内皮功能参与心血管疾病的病理生理过程^[38]。

概括地说，VEC通过EndMT补充受损的VIC，一旦EndMT发生，VEC即参与到瓣膜的病理性纤维化和钙化。VEC的EndMT通过纤维化促进细胞外基质重塑，促进成骨活动参与CAVD的发生、发展^[43-44]。但同时有学者通过共培养VIC和VEC发现VIC可以抑制VEC的钙化。上述结果提示VIC与VEC互相作用，共同维持瓣叶的稳定性^[45]。

目前研究认为，VEC调控VIC旁分泌的因子主要为一氧化氮（nitric oxide，NO）和C型钠尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP），两者均通过诱导环磷酸鸟苷的产生发挥作用。Lee等^[46]研究发现，一氧化氮合酶敲除小鼠BAV患病率明显增加，伴随着CAVD的发病率上升。Richards等^[47]通过将VEC与VIC共培养证实，VEC可抑制VIC活化及其向成骨细胞分化，而在培养液中添加NO阻断剂后作用却相反，即促进钙化。由于NO仅能在VEC中合成，上述研究结果提示VEC通过合成NO成为瓣膜钙化早期阶段天然的抑制剂。血流剪切力会使VEC中一氧化氮合酶的表达水平升高，而在体外NO可以抑制VIC介导的钙化结节形成^[48-49]。研究发现，miRNA-195和miRNA-582能抑制内皮型一氧化氮合酶的表达，从而抑制NO的释放^[50]。

CNP可于正常主动脉瓣组织中表达，尤其是在心室侧的内皮细胞中高表达，而在狭窄的主动脉瓣中其表达会降低^[51]。CNP能够抑制VIC活化以及向成骨细胞分化，利用基因敲除技术证实，利钠肽受体2缺失的小鼠BAV、主动脉瓣疾病及升主动脉扩张发病率升高^[52]。上述研究表明CNP在维持主动脉瓣正常功能中具有重要作用。

CAVD是一个涉及内皮损伤、慢性炎症、细胞外基质重塑、细胞表型分化等复杂病理变化的过程。CAVD启动阶段以瓣膜损伤、炎症为诱发因素，而在进展阶段钙化和促成骨因素成为促使疾病进展的主要因素。VIC和VEC均可能以多种形式参与CAVD的发生、发展，而非编码RNA则主要通过转录后调控机制参与其进程。正常状态下VIC与VEC互相作用，共同维持瓣叶的稳定性，而这种稳态一旦被打破，主动脉瓣则逐步向CAVD发展。因此，研究VIC和VEC在CAVD进程中的作用及机制可能为CAVD的防治提供新的治疗策略。此外，非编码RNA还可能作为潜在的生物标志物用于评估CAVD的发生、发展与预后。

尽管已经有大量有关CAVD细胞及分子水平的文献报道，但人们对VIC和VEC参与CAVD具体机制的了解仍然有限，非手术手段治疗CAVD仍面临较大的挑战。