2019, Vol. 40
2. 泰州市中医院胸外科, 泰州 225309;
3. 海军军医大学(第二军医大学)长海医院呼吸与危重症医学科, 上海 200433;
4. 复旦大学现代人类学教育部重点实验室, 上海 200433;
5. 复旦大学泰州健康科学研究院, 泰州 225300;
6. 海军军医大学(第二军医大学)长海医院健康体检中心, 上海 200433
, LU Cheng-jun2, WU Jun-jie3,4
, LI Yu-tao4, NI Hong-yu4, JIN Li4,5, LU Da-ru4,5, WANG Jiu-cun4,5, LI Ju-hong6
2. Department of Thoracic Surgery, TCM Hospital of Taizhou, Taizhou 225309, Jiangsu, China;
3. Department of Respiratory Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China;
4. Key Laboratory of Contemporary Anthropology of Ministry of Education, Fudan University, Shanghai 200433, China;
5. Taizhou Institute of Health Sciences, Fudan University, Taizhou 225300, Jiangsu, China;
6. Center of Physical Examination, Changhai Hospital, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]，临床上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两类，后者主要包括鳞状细胞癌和腺癌。多数肺癌患者在确诊时已为中晚期，5年生存率仅为5%，因此肺癌的早期诊断至关重要[2-4]。
亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是人体叶酸和甲硫氨酸代谢途径关键酶，其催化5, 10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，后者为同型半胱氨酸转变为甲硫氨酸的过程提供甲基，参与DNA甲基化与核酸合成。MTHFR基因位于人染色体1p36.3，全长约20 kb，包括12个外显子[5]。MTHFR rs1801133是位于MTHFR基因第4号外显子677核苷酸位点的C＞T [丙氨酸（alanine，Ala）→缬氨酸（valine，Val）]点突变，该突变使酶活性和耐热性降低；突变的纯合子型（TT型）和杂合子型（CT型）基因在46 ℃加热5 min后其酶活性分别降至22%和56%，而野生型（CC型）基因的酶活性降低至67%，导致DNA甲基化与核酸合成不稳定，并可能增加罹患心血管疾病的风险[6-7]。
研究发现，MTHFR基因rs1801133位点多态性与结直肠癌[8-9]、食管癌[10-11]、胃癌[12]和肝癌[13]等肿瘤发生风险有关，其与肺癌发生风险之间的关系仍存在争议[14-17]。为进一步验证MTHFR基因rs1801133位点多态性是否与肺癌的发生风险相关，本研究以上海和江苏泰州地区人群为研究对象，采集其血液标本进行病例-对照研究。
1 资料和方法 1.1 一般资料2009年1月至11月从海军军医大学（第二军医大学）长海医院、复旦大学泰州健康科学研究院等单位收集肺癌患者的血液标本。纳入标准：经组织病理学检查确诊的新发肺癌患者，无其他器官恶性肿瘤史，未接受过放射治疗或化学治疗，无年龄、性别限制。健康对照组按年龄、性别、地域范围与病例组进行频数匹配的原则，选择同一时期相应地区或社区健康体检者的血液标本。本研究通过复旦大学生命科学学院伦理委员会审核批准，流行病学调查资料收集及血液样本采集均获得研究对象知情同意。
1.2 血液样本采集及DNA提取用EDTA抗凝管采集外周静脉血1.5 mL。采用血液基因组DNA小量提取试剂盒（上海莱枫生物科技有限公司）提取全血基因组DNA，依照试剂盒说明书进行操作。
1.3 MTHFR基因分型采用SNPscanTM试剂盒（上海天昊生物科技有限公司），通过高特异性连接反应对单核苷酸多态性位点进行等位基因判别。基因分型质量控制按照质量控制流程进行，包括＞95%的基因分型检出率、重复检出的基因型、内部阳性对照样品检测。
1.4 统计学处理应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，计数资料以例数和百分数表示。人口统计变异值、人群吸烟状况、恶性肿瘤家族史、病例组与健康对照组等位基因频率差异及哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）采用χ2检验分析。分别对基因型模型、等位基因模型、显性基因模型、隐性基因模型进行非条件logistic回归分析，采用输入法筛选变量，计算比值比（odds ratio，OR）和95%置信区间（confidence interval，CI），校正年龄、性别、吸烟状况及恶性肿瘤家族史后进一步计算OR和95% CI。按照年龄、性别、吸烟状况及恶性肿瘤家族史进行模型分析，评估MTHFR rs1801133位点多态性与肺癌发生风险的关联。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 研究对象的一般情况共纳入肺癌患者974例，其中来源于海军军医大学（第二军医大学）长海医院536例、复旦大学泰州健康科学研究院352例、上海地区其他医院86例，年龄15~90岁，中位年龄为62岁，平均年龄为（62.2±10.8）岁；健康对照组1 005例，年龄28~80岁，中位年龄为63岁，平均年龄为（62.2±10.7）岁。如表 1所示，病例组和健康对照组的年龄分布和性别构成差异均无统计学意义（P均＞0.05）；吸烟者分别占病例组与健康对照组的69.8%（680/974）和50.0%（502/1 005），差异有统计学意义（P＜0.001）；有癌症家族史者分别占病例组与健康对照组的34.6%（337/974）和14.6%（147/1 005），差异有统计学意义（P＜0.001）。
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表 1 研究对象的一般情况 Tab 1 General information of subjects |
2.2 MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌易感性的相关性
MTHFR基因rs1801133位点检测出CC基因型600个、CT基因型904个、TT基因型381个，基因型检出率为95.25%；C/T位点基因型频率符合HWE定律（P=0.225）。
MTHFR基因rs1801133位点等位基因C的频率在病例组和健康对照组中分别为57.8%（1 037/1 794）、54.0%（1 067/1 976），等位基因T的频率在病例组和健康对照组中分别为42.2%（757/1 794）、46.0%（909/1 976），两组间等位基因频率差异均无统计学意义（P均＞0.05）。CT基因型与TT基因型个体肺癌的发生风险均低于CC基因型个体（OR=0.801，95% CI：0.651~0.985，P=0.035；OR=0.754，95% CI：0.582~0.975，P=0.032），但经性别、年龄、吸烟状况和恶性肿瘤家族史校正后差异均无统计学意义（校正后OR=0.841，95% CI：0.677~1.045，P=0.118；OR=0.799，95% CI：0.609~1.047，P=0.104）。在显性模型中，CT+TT基因型个体肺癌的发生风险低于CC基因型个体（OR=0.787，95% CI：0.648~0.955，P=0.015），但校正后差异无统计学意义（校正后OR=0. 828，95% CI：0.675~1.016，P=0.070）。在隐性模型中，TT基因型个体与CC+CT基因型个体肺癌的发生风险差异无统计学意义（校正后OR=0.886，95% CI：0.698~1.123，P=0.319）。结果说明MTHFR基因rs1801133位点C＞T突变与肺癌发生风险关系不明显。
2.3 MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌易感性分层分析校正后分层分析结果（表 2）显示，等位基因C＞T突变男性、恶性肿瘤家族史阳性者肺癌的发生风险降低（OR=0.843，95% CI：0.717~0.993，P=0.040；OR=0.738，95% CI：0.553~0.985，P=0.039）；按肿瘤组织学类型统计，鳞状细胞癌发生风险降低（OR=0.814，95% CI：0.666~0.995，P=0.045）。在基因型模型（表 3）中，与CC基因型恶性肿瘤家族史阳性者相比，CT基因型肿瘤家族史阳性者肺癌发生风险降低（OR=0.603，95% CI：0.376~0.957，P=0.033）；TT基因型患者与CC基因型患者各影响因素在肺癌发生风险上的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。在显性模型（表 4）中，CT+TT基因型男性、恶性肿瘤家族史阳性者较CC基因型对应人群肺癌发生风险均降低（OR=0.764，95% CI：0.597~0.977，P=0.032；OR=0.600，95% CI：0.385~0.925，P=0.022），CT+TT基因型人群发生肺鳞状细胞癌的风险较CC基因型人群降低（OR=0.727，95% CI：0.542~0.976，P=0.033）。隐性模型中未见阳性结果（表 5）。
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表 2 等位基因模型中MTHFR 基因rs1801133位点多态性与肺癌发生风险关联分析 Tab 2 Stratified analysis of association between MTHFR rs1801133 alleles and risk of lung cancer |
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表 3 基因型模型中MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌发生风险关联分析 Tab 3 Stratified analysis of association between MTHFR rs1801133 genotypes and risk of lung cancer |
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表 4 显性模型中MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌发生风险关联分析 Tab 4 Stratified analysis of association between dominant model of MTHFR rs1801133 and risk of lung cancer |
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表 5 隐性模型中MTHFR 基因rs1801133位点多态性与肺癌患病风险关联分析 Tab 5 Stratified analysis of association between recessive model of MTHFR rs1801133 and risk of lung cancer |
3 讨论
本研究发现上海和江苏泰州地区人群中MTHFR基因rs1801133 C＞T突变与肺癌的发生风险呈负相关，但经年龄、性别、吸烟状况和恶性肿瘤家族史校正后不再具有相关性。校正后分层分析发现，男性、恶性肿瘤家族史阳性和鳞状细胞癌患者中该位点多态性与肺癌发生风险呈负相关。
在我国，一项针对湖北地区人群的研究分析了93例肺癌患者，发现MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌发生风险无相关性[14]。针对河南202例[15]及云南省宣威地区120例[16]肺癌患者的研究提示MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌发病呈正相关，而福建和江苏地区521例[17]及台湾地区358例[18]肺癌患者的研究结果显示MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌患病风险呈负相关。上述结果表明MTHFR基因rs1801133位点多态性与肺癌风险的关系在不同地区人群间不尽相同，这可能是由于研究样本量较小且未考虑该位点在不同致病因素（如性别、吸烟等）暴露下与肺癌易感性的关系，结果可能存在偏倚[17, 19]。为进一步明确MTHFR基因rs1801133位点与肺癌风险之间的关系，我们进行了大样本病例-对照研究，通过对性别、年龄、吸烟状况、恶性肿瘤家族史、肿瘤组织学类型等因素分层分析，发现男性和肿瘤家族史阳性患者中，rs1801133 C＞T突变携带者发生肺癌的风险降低，且C＞T突变携带者患鳞状细胞癌的风险也明显降低。
研究发现，MTHFR基因rs1801133 CT与TT基因型前列腺癌患者血清同型半胱氨酸水平明显升高，彗星实验显示rs1801133 C＞T突变会导致DNA损伤，将载有rs1801133 C＞T突变型基因序列的慢病毒感染前列腺癌LNCaP和PC3细胞后，细胞内同型半胱氨酸水平升高并出现细胞凋亡增加和增殖受抑制的现象[20]，提示MTHFR基因rs1801133位点C＞T突变是肿瘤发生的可能机制。此外，通过32P-后标记法发现MTHFR基因rs1801133位点CC基因型肺癌患者血清与肺癌组织DNA加合物浓度差明显大于CT基因型和TT基因型肺癌患者，具体机制尚不清楚，推测rs1801133 CC基因型的患者对DNA加合物修复能力减弱，致肺癌的发生风险增加[21]。
综上所述，MTHFR基因rs1801133位点C＞T突变降低了男性和恶性肿瘤家族史阳性者肺癌的发生风险，尤其是鳞状细胞癌的患病风险。未来我们将进一步扩大样本进行细胞分子实验，深入探索该位点多态性在肺癌发生、发展中的具体机制。
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