第二军医大学学报  2019, Vol. 40 Issue (6): 700-703   PDF    
引用本文
万胜利, 何丹, 晏子俊, 李瑶, 张景勍. 载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体的理化特性和药代动力学[J]. 第二军医大学学报, 2019, 40(6): 700-703  
WAN Sheng-li, HE Dan, YAN Zi-jun, LI Yao, ZHANG Jing-qing. Physicochemical properties and pharmacokinetics of hydroxypropyl-β-cyclodextrin liposomes containing L-asparaginase[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2019, 40(6): 700-703 (in Chinese with English abstract)  
载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体的理化特性和药代动力学
万胜利, 何丹, 晏子俊, 李瑶, 张景勍     
重庆医科大学药学院重庆高校药物工程研究中心, 重庆 400016
收稿日期: 2018-10-27    接受日期: 2019-01-23
基金项目: 国家自然科学基金（30973645）.
作者简介: 万胜利, 硕士, 药师(现工作单位为西南医科大学附属医院).E-mail:wanshengli0000@163.com
通信作者(Corresponding author): 张景勍, Tel:023-68485161, E-mail:zjqrae01@163.com
摘要: 目的 考察载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体（AHL）的理化性质及其在大鼠体内的药代动力学特性。方法 采用逆相蒸发法制备AHL，考察其包封率、粒径、zeta电位和形态。取12只SD大鼠随机分成两组，分别尾静脉注射AHL和天冬酰胺酶（L-ASN），给药后定时眼眶下静脉丛取血，测定血浆样品中L-ASN的活性并绘制活性-时间曲线，采用DAS 2.1.1软件分析计算主要的药代动力学参数。结果 AHL的平均包封率为（53.53±0.58）%，平均粒径为（388.99±2.02）nm，平均zeta电位为（-8.56±0.75）mV，透射电镜下观察为类球形。AHL的活性-时间曲线下面积大于L-ASN，AHL和L-ASN的0~48 h曲线下面积分别为（198.79±9.15）、（57.78±2.90）U/（mL · h），0~48 h平均滞留时间分别为（4.61±0.09）、（2.09±0.05）h，峰浓度分别为（32.32±1.33）、（26.82±1.38）U/mL，达峰时间分别为（1.08±0.20）、（0.10±0.04）h。AHL相对L-ASN的生物利用度为344.05%。结论 AHL能改善L-ASN的药代动力学特性，提高其生物利用度。
关键词: 天冬酰胺酶    羟丙基-β-环糊精脂质体    理化特性    药代动力学    
Physicochemical properties and pharmacokinetics of hydroxypropyl-β-cyclodextrin liposomes containing L-asparaginase
WAN Sheng-li, HE Dan, YAN Zi-jun, LI Yao, ZHANG Jing-qing     
Medicine Engineering Research Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Supported by National Natural Science Foundation of China (30973645).
Abstract: Objective To investigate the physicochemical properties and pharmacokinetics of L-asparaginase loaded hydroxypropyl-β-cyclodextrin liposome (AHL) in rats. Methods AHL was prepared by reverse evaporation method, and the entrapment rate, particle size, zeta potential and morphology of AHL were observed. Twelve SD rats were randomly divided into two groups. One group was injected with AHL, and the other group was injected with L-asparaginase (L-ASN). The blood samples were taken from infraorbital venous plexus, and the activity of L-ASN in the samples were determined and the activity-time curve was plotted. Main pharmacokinetic parameters were calculated by software DAS2.1.1. Results The average entrapment efficiency of AHL was (53.53±0.58)%, with an average particle size of (388.99±2.02) nm and an average zeta potential of (-8.56±0.75) mV. The pharmacokinetic parameters for AHL and L-ASN were:0-48 h area under curve (198.79±9.15) U/(mL·h), (57.78±2.90) U/(mL·h); 0-48 h mean resident time (4.61±0.09) h, (2.09±0.05) h; peak concentration (32.32±1.33) U/mL, (26.82±1.38) U/mL; and time to peak (1.08±0.20) h, (0.10±0.04) h, respectively. The relative bioavailability of AHL was 344.05%. Conclusion AHL can improve the pharmacokinetics and enhance the bioavailability of L-ASN.
Key words: asparaginase    hydroxypropyl-β-cyclodextrin liposomes    physicochemical properties    pharmacokinetics    

天冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASN)是治疗急性淋巴白血病和淋巴瘤的有效药物[1]。天冬酰胺是癌变淋巴母细胞生长所必需的氨基酸，L-ASN通过消耗天冬酰胺发挥抗癌作用[2]。L-ASN是蛋白多肽类药物，与传统合成药物相比，其对正常细胞和组织的毒副作用较轻，但在体内易失活、稳定性差、生物利用度低，限制了其临床应用[3]。羟丙基-β-环糊精脂质体是一类新型药物载体，药物被羟丙基-β-环糊精包合后再制备成脂质体能提高药物包封率，增强药物稳定性，并能提高药物的生物利用度，具有良好的应用前景[4-5]。目前，国内尚未见羟丙基-β-环糊精脂质体载治疗酶的研究报道，本研究首次将L-ASN制备成载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体(L-asparaginase loaded hydroxypropyl-β-cyclodextrin liposome，AHL)，以期提高L-ASN的稳定性和生物利用度。

1 材料和方法 1.1 药品、试剂与仪器

L-ASN(以色列Prospec公司，纯度＞96%，批号：312PLASP11)，天冬酰胺、胆固醇(美国Sigma公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris，国药集团化学试剂有限公司)，磷脂(德国Lipoid公司)，乙醚、二氯甲烷[重庆川东化工(集团)有限公司]。A200S型精密电子天平(德国赛多利斯公司)，G16型医用离心机(北京白洋医疗器械有限公司)，PHS-25型酸度计(上海雷磁仪器厂)，HWCL-3型集热式恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)，Zetasizer Nano型激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)，JEM-1400Plus型透射电子显微镜(日本电子株式会社)。

1.2 实验动物

清洁级SD大鼠，体质量(200±20)g，雄性，由重庆医科大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(渝)2014-0001。

1.3 AHL的制备

采用逆相蒸发法制备AHL[5-6]。称取适量胆固醇、卵磷脂，加15 mL二氯甲烷溶解，减压蒸发至形成均匀透明薄膜，加15 mL乙醚溶解已形成的薄膜，然后加入L-ASN羟丙基-β-环糊精包合物溶液10 mL，冰浴中超声后，旋转蒸发至形成乳白色均匀混悬液，即得AHL。将L-ASN及AHL置于4 ℃环境下，于第0、1、5、10、15、20、25、30天分别测定各溶液中L-ASN的活性，考察其稳定性。

1.4 AHL包封率的测定

采用葡聚糖凝胶柱法测定AHL的包封率[6]。取AHL混悬液上葡聚糖凝胶G-200柱，Tris-盐酸缓冲液(pH 7.3)洗脱，流速为1.0 mL/min，分离AHL与游离酶，接取AHL部分，乙醚破乳后离心。取上清液加入考马斯亮蓝G-250溶液显色，于波长595 nm处测定其光密度值，计算过柱后的AHL中L-ASN的含量(W1)。另取相同体积未过柱的AHL同法测定，计算出其中L-ASN的含量(W2)。包封率=(W1/W2)×100%。

1.5 AHL粒径、zeta电位与形态的测定[3]

取AHL混悬液，用pH为7.3的Tris-盐酸缓冲液稀释20倍，混合均匀后使用马尔文激光粒度仪测定其粒径与zeta电位；同时取部分稀释液滴加在铜网上，用1%的磷钨酸染色，晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。

1.6 AHL药代动力学的测定

取12只SD大鼠随机分为两组，每组6只，分别静脉注射AHL和L-ASN，剂量均为2 U/g，给药后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h眼眶下静脉丛取血，置于肝素化的离心管中，1 006×g离心10 min，取上层血浆样品，采用奈斯勒试剂显色法测定L-ASN的活性[3, 7]。L-ASN活性单位定义为：在37 ℃、pH 7.3的条件下，每分钟催化天冬酰胺水解释放1 μmol氨所需的酶量。根据所测结果绘制活性-时间曲线，采用DAS 2.1.1软件计算主要的药代动力学参数[8]。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。数据以x±s表示，两组间比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 AHL的制备

成功制备得到AHL。如图 1所示，4 ℃环境下30 d内AHL的稳定性优于L-ASN(P＜0.05)。

图 1 L-ASN和AHL稳定性考察 L-ASN:天冬酰胺酶; AHL:载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体. *P＜0.05与L-ASN比较. n=3, x±s

2.2 AHL的包封率、粒径、zeta电位与形态

测得AHL的平均包封率为(53.53±0.58)%，平均粒径为(388.99±2.02)nm，平均zeta电位为(-8.56±0.75)mV。由图 2可见，制备得到的AHL呈类球形，大小分布较均匀。

图 2 载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体的透射电子显微镜图

2.3 AHL的活性-时间曲线

SD大鼠分别静脉注射AHL和L-ASN后定时采血，测定不同时间点血浆中L-ASN的活性(AHL组中L-ASN的活性是包载与游离L-ASN活性的总和)。如图 3所示，AHL的活性-时间曲线下面积大于L-ASN(P＜0.05)。在大鼠体内，注射L-ASN后大鼠血浆中L-ASN的活性迅速下降，8 h时已接近于0 U/mL；而注射AHL后大鼠血浆中L-ASN的活性下降趋势缓慢，12 h时仍能检测到较高活性。这表明AHL能提高L-ASN在大鼠体内的血药浓度水平，延长其作用时间。

图 3 L-ASN和AHL的活性-时间曲线 L-ASN:天冬酰胺酶; AHL:载天冬酰胺酶羟丙基-β-环糊精脂质体. n=6, x±s

2.4 AHL的主要药代动力学参数

L-ASN和AHL的主要药动学参数见表 1。与L-ASN相比，AHL的相对生物利用度为344.05%，说明AHL能提高L-ASN的生物利用度。AHL的0~48 h平均滞留时间约为L-ASN的2.21倍，表明AHL能延长L-ASN在生物体内的作用时间。AHL的峰浓度(Cmax)约为L-ASN的1.2倍，表明AHL能提高L-ASN在生物体内的活性。AHL的达峰时间(Tmax)约为L-ASN的10.8倍，表明AHL具有缓释作用。

表 1 L-ASN和AHL的主要药代动力学参数

3 讨论

本研究采用逆相蒸发法制备AHL。制备脂质体的方法很多，如薄膜分散法、乙醇注入法、冷冻干燥法及逆相蒸发法等[3-4, 9-10]。薄膜分散法用于难溶性，尤其是挥发油类药物的制备；乙醇注入法制备速度慢，不适合大规模生产，用于醇溶性及挥发油类药物的制备；冷冻干燥法制备的脂质体稳定性好，但是需要加入保护剂，用于热不稳定性药物的制备；逆相蒸发法应用广、包封率高，适合制备水溶性的大分子类药物，通常采用逆相蒸发法制备酶类脂质体[3, 6]。酶类脂质体的包封率普遍不高，有些甚至低至10%，本研究中AHL的平均包封率为(53.53±0.58)%，高于L-ASN脂质体[11]，远高于抗自由基复酶脂质体[12]，表明AHL的包封较好。粒径和zeta电位是评价脂质体的重要指标。脂质体的粒径一般为50~1 000 nm[13]，而酶类药物脂质体的粒径一般为250~850 nm[13-16]，本研究中AHL的平均粒径为(388.99±2.02)nm，与文献报道一致。

有文献报道，大鼠静脉注射L-ASN纳米囊后峰浓度为29.95 U/mL，0~48 h曲线下面积为137.34 U/(mL • h)[7]。本研究中AHL的给药剂量与L-ASN纳米囊[7]一致，其峰浓度较天冬酰胺酶纳米囊提高了8%，且其相对L-ASN纳米囊的生物利用度为144.32%，而AHL相对L-ASN的生物利用度为344.05%，可见AHL能有效提高药物的生物利用度。分析AHL生物利用度提高的原因可能有：(1)羟丙基-β-环糊精脂质体对药物有保护作用，能提高L-ASN抗吞噬细胞清除和抗蛋白酶水解的能力[17-19]；(2)羟丙基-β-环糊精脂质体能增强药物的稳定性，使L-ASN长时间保持较高活性[18, 20]。本研究中静脉注射AHL 1 h后大鼠血浆中L-ASN的活性最高，这与尿酸酶多囊脂质体静脉注射1 h后出现最大活性[15]类似。

综上所述，AHL能有效改善L-ASN的药代动力学特性，提高其生物利用度。本研究成功制备了AHL，为L-ASN及其他蛋白多肽类药物的临床应用奠定了基础。

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