肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一，预后不良，是全球癌症死亡的第二大原因^[1]，据统计，2018年因HCC死亡的人数约占癌症总死亡人数的9.1%^[1-2]。尽管医疗技术发展迅速，但HCC仍然没有可治愈的策略。因此，探寻评估HCC进展和预后的特异性标志物具有重要的临床意义。C型凝集素结构域家族1成员B（C-type lectin domain family 1 member B，CLEC1B）又称C型凝集素样受体2（C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2），是一种血小板相关分子，该分子由肿瘤周围的活化血小板分泌，并对血小板聚集和肿瘤转移具有抑制作用^[3-4]。近年研究发现CLEC1B在HCC中表达下调并能预测患者的临床结局，其可能是程序性细胞死亡蛋白1及其配体（programmed cell death 1/programmed cell death ligand 1，PD-1/PD-L1）免疫疗法的潜在治疗靶标^[5-6]。本研究通过生物信息学方法和临床病例资料评估CLEC1B在HCC中的表达变化，分析CLEC1B表达与HCC患者临床病理特征之间的关系，并探讨CLEC1B对HCC的潜在预后意义。

利用基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc＝GSE49515, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc＝GSE115018）检索HCC组织芯片数据（GSE49515、GSE115018），对癌组织及正常对照样本中的基因进行差异表达分析。在肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（http://ualcan.path.uab.edu/cgi-bin/TCGAExResultNew2.pl?genenam＝CLEC1B&ctype＝LIHC）筛选HCC转录组数据集，以获得来自50个非肿瘤肝组织和371个HCC癌组织的RNA测序数据，获取CLEC1B的表达水平和HCC患者的随访信息。

使用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）软件（http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）探寻HCC中与CLEC1B相关的信号通路。通过排列分析1 000次获得归一化富集分数（normalized enrichment score，NES）。GSEA中显著富集基因组的标准为P＜0.05，错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.25。

收集海军军医大学（第二军医大学）东方肝胆外科医院2014年1月至2015年12月经手术切除治疗的37例HCC患者的癌组织和相应的癌旁组织（距癌组织边缘至少2 cm），保存于液氮中；获取患者外周静脉血样本，分离血浆后置于EP管，保存于－80 ℃冰箱。37例HCC患者中，男28例、女9例，年龄为32~78岁（中位年龄为55岁）。所有入选患者术前均未接受放射治疗或化学治疗。收集患者年龄、性别、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、肿瘤大小、肿瘤数量、肿瘤分化程度、TNM分期、血管侵犯和肿瘤出血等资料。以海军军医大学（第二军医大学）东方肝胆外科医院同期37例健康体检者为健康对照组，其中男22例、女15例，年龄为28~77岁（中位年龄为51岁），获取外周静脉血样本并分离血浆。本研究通过海军军医大学（第二军医大学）东方肝胆外科医院临床试验伦理委员会批准，所有研究对象均对研究知情同意，并签署知情同意书。

采用TRIzol试剂盒（美国Invitrogen公司）提取样本组织的总RNA，使用反转录试剂盒（日本TaKaRa公司）将RNA反转录成cDNA。使用SYBR Premix EX Taq试剂盒（日本TaKaRa公司）进行加样，样品在实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）中进行扩增反应。反应体系为25 µL：SYBR Mix 12.5 µL，上游和下游引物各0.5 µL，cDNA 2.5 µL，RNase Free ddH₂O 9 µL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，连续进行40个循环。引物序列：CLEC1B上游5'-AGC GCA ATT ACC TAC AAG GTG-3'，下游5'-CTT CCC ATG TTA AGT TGT GCC T-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游5'-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3'，下游5'-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3'。以GAPDH为内参照，采用2^－ΔΔCt法计算产物相对表达量。

使用总蛋白提取试剂盒（美国Bio-Rad公司）提取组织切片总蛋白，用BCA法测蛋白水平。取50 μg总蛋白，变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用半干法将电泳产物转移到聚偏氟乙烯膜上，以5%脱脂奶粉封闭（4 ℃封闭2 h），滴加CLEC1B抗体（英国Abcam公司）4 ℃过夜；用TBST洗膜4次，每次10 min，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（英国Abcam公司），37 ℃孵育2 h；用TBST洗膜4次，每次10 min。使用化学发光试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）进行显色，用凝胶电泳成像分析系统（南京驰顺科技发展有限公司，型号：GIS300）自动成像。以GAPDH为内参照分析CLEC1B蛋白的相对含量。

采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血浆中CLEC1B蛋白水平，试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司。在各孔中加入受试者血浆样本、标准品及反应液，应用多功能酶标分析仪（深圳汇松科技发展有限公司，型号：MB-580）检测450 nm波长处光密度值。利用空白孔及标准孔拟合logistic曲线，计算HCC患者血浆中CLEC1B蛋白水平。

采用电话随访的方式对所有患者及家属进行随访，采用门诊随访方式对仍存活患者进行随访。随访截止日期为2019年1月。所有患者均完成随访。

应用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。服从正态分布的计量资料以x±s表示，两组间的比较采用独立样本t检验或配对t检验；不服从正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，两组间的比较采用非参数检验。计数资料的组间比较采用χ²检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估CLEC1B诊断HCC的价值，以约登指数（约登指数＝灵敏度+特异度－1）最大值为截断值。采用Kaplan-Meier法进行生存分析，组间差异的比较采用log-rank检验。检验水准（α）为0.05。

利用GEO数据库HCC组织芯片数据（GSE49515、GSE115018）获得癌组织和正常对照样本中的差异表达基因，图 1A和1B所示分别为来自2个芯片的前20个差异表达基因，可见CLEC1B在HCC癌组织中表达下调。将2个芯片的差异表达基因取交集，结果如图 1C所示。在TCGA数据库中对CLEC1B的表达水平进行检索，结果（图 1D）亦显示CLEC1B在HCC癌组织中的表达下调。为了进一步证明CLEC1B在HCC癌组织中的差异表达，利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测37例HCC患者临床配对样本中CLEC1B的表达，结果（图 1E、1F）显示癌组织中CLEC1B mRNA和蛋白表达水平均低于癌旁组织，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图 1 CLEC1B在HCC癌组织中的差异表达 Fig 1 Differential expression of CLEC1B in cancer tissues of HCC patients A: GSE49515 chip analysis of differential expression clustering heat map of HCC in GEO database; B: GSE115018 chip analysis of differential expression clustering heat map of HCC in GEO database; C: Wayne map of chip differential gene results; D: Expression of CLEC1B gene in HCC in TCGA database; E: Quantitative real-time PCR detection of CLEC1B mRNA expression level of 37 HCC patients; F: CLEC1B protein expression of 37 HCC patients by Western blotting. CLEC1B: C-type lectin domain family 1 member B; HCC: Hepatocellular carcinoma; GEO: Gene Expression Omnibus; TCGA: The Cancer Genome Atlas. *P < 0.05

37例HCC患者中，利用mRNA检测结果取均值，以高于均值为高表达，低于均值为低表达。其中，CLEC1B高表达者16例，低表达者21例。经χ²检验发现，CLEC1B低表达组中存在肿瘤出血的患者比例高于CLEC1B高表达组，差异有统计学意义（P＜0.01）。CLEC1B与HCC患者临床病理特征的关系见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 CLEC1B表达与HCC患者临床病理特征的关系 Tab 1 Relationship between CLEC1B expression and clinicopathological characteristics of HCC patients n Characteristic Total N＝37 CLEC1B χ2 value P value High expression N＝16 Low expression N＝21 Age (year)       0.108 0.896   ＜55 15 6 9       ≥55 22 10 12     Gender       0.735 0.458   Male 28 11 17       Female 9 5 4     α-Fetoprotein ρB (ng·mL-1)       0.187 0.746   ≤20.0 20 8 12       ＞20.0 17 8 9     Hepatitis B surface antigen       3.416 0.099   Negative 19 11 8       Positive 18 5 13     Tumor size d/cm       1.648 0.291   ≤5 12 7 5       ＞5 25 9 16     Tumor number n       4.259 0.052   1 16 10 6       ≥2 21 6 15     Tumor differentiation       3.997 0.067   Ⅰ-Ⅱ 10 7 3       Ⅲ-Ⅳ 27 9 18     TNM stage       3.111 0.104   Ⅰ 20 6 14       Ⅱ-Ⅲ 17 10 7     Vascular invasion       0.001 0.998   Yes 23 10 13       No 14 6 8     Tumor hemorrhage       13.977 ＜0.001   Yes 24 5 19       No 13 11 2     CLEC1B: C-type lectin domain family 1 member B; HCC: Hepatocellular carcinoma

表 1 CLEC1B表达与HCC患者临床病理特征的关系 Tab 1 Relationship between CLEC1B expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

对37例HCC患者血浆中CLEC1B蛋白水平进行ROC曲线分析，见图 2，得出CLEC1B诊断HCC的最佳截断值为62.44 ng/mL（曲线下面积为0.966，95%置信区间：0.957~0.975，P＜0.01）。以62.44 ng/mL作为CLEC1B诊断HCC的标准，可达到最佳诊断效能（灵敏度为92.7%，特异度为91.3%）。

图 2 CLEC1B诊断HCC的ROC曲线分析 Fig 2 ROC curve analysis of CLEC1B in diagnosis of HCC CLEC1B: C-type lectin domain family 1 member B; HCC: Hepatocellular carcinoma; ROC: Receiver operating characteristic; AUC: Area under curve; CI: Confidence interval

采用Kaplan-Meier法分析HCC患者的生存情况，通过log-rank检验分析CLEC1B mRNA表达与HCC患者预后的关系，结果显示CLEC1B高表达组患者的总生存期延长，与CLEC1B低表达组相比差异有统计学意义（P＜0.01，图 3）。

图 3 CLEC1B表达与HCC患者预后的关系 Fig 3 Relationship between CLEC1B and prognosis of HCC patients CLEC1B: C-type lectin domain family 1 member B; HCC: Hepatocellular carcinoma

通过对CLEC1B低表达和高表达数据集进行GSEA分析，探寻在HCC中与CLEC1B基因相关的信号通路，结果（图 4）显示，在HCC中CLEC1B基因与ATR信号通路（ATM and Rad3-related pathway）、细胞周期通路、DNA修复通路、myc信号通路呈现出一致的表达差异趋势。

图 4 GSEA鉴定HCC中与CLEC1B基因相关的信号通路 Fig 4 GSEA identifying signaling pathways associated with CLEC1B gene A: ATR pathway; B: Cell cycle pathway; C: G2 pathway; D: G1 pathway; E: DNA repair pathway; F: Myc signaling pathway. GSEA: Gene Set Enrichment Analysis; HCC: Hepatocellular carcinoma; CLEC1B: C-type lectin domain family 1 member B; ATR: ATM and Rad3-related

HCC往往进展快速、预后不良，对大多数常规抗肿瘤药耐药，其已成为世界性的难题^[7]。在临床实践中，分子生物标志物是预测患者疾病进展和预后的重要工具。CLEC1B是诱导血小板聚集的蛇毒毒素的活化受体，能够抑制血小板聚集^[8]，对于维持整体血管完整性必不可少^[9]，可调节Toll样受体激动剂并促进白细胞介素10的产生^[10]。CLEC1B具有内源性配体，即在淋巴内皮、次级淋巴器官基质和一些肿瘤细胞上发现的黏蛋白样糖蛋白podoplanin^[3]。CLEC1B与podoplanin结合后可引发强烈的血小板活化，从而促进肿瘤转移^[11]。在动物模型中使用药物抑制CLEC1B与podoplanin结合后，可抑制肿瘤转移，并增强顺铂的治疗效果^[12]。上述证据表明CLEC1B在肿瘤免疫调节和转移中具有潜在作用，可能通过抑制性免疫调节和血小板活化2种方式介导肿瘤进展，并有望成为肿瘤治疗的靶标。目前有关HCC中CLEC1B表达及作用的研究不多，Hu等^[6]研究发现CLEC1B可能是PD-1/PD-L1免疫疗法的潜在靶标，并且其低表达可能是存在肿瘤出血的HCC的一个有价值的预后因素。

本研究利用生物信息学分析和临床样本资料证实CLEC1B在HCC中低表达，并且CLEC1B低表达与肿瘤出血有关，与既往研究结果^[6]一致。本研究还分析了血浆中CLEC1B水平对HCC的诊断价值，结果显示，以62.44 ng/mL作为截断值时，CLEC1B的诊断效能最佳（ROC曲线下面积为0.966，灵敏度为92.7%，特异度为91.3%），提示血浆中CLEC1B水平可作为诊断HCC的生物标志物。此外，本研究还通过GSEA鉴定了HCC中与CLEC1B基因相关的信号通路，结果发现在HCC中，CLEC1B基因与ATR通路、细胞周期通路、DNA修复通路、myc信号通路呈现出一致的表达差异趋势，提示这些通路可能与HCC中CLEC1B的作用机制有关，但今后仍需开展相关分子细胞生物学实验加以验证。

综上所述，本研究发现HCC中CLEC1B呈低表达状态并与肿瘤出血有关，血浆中CLEC1B水平可作为诊断HCC的生物标志物；ATR通路、细胞周期通路、DNA修复通路、myc信号通路可能与HCC中CLEC1B的作用机制有关，但仍需进一步验证。CLEC1B有望成为HCC诊断和预后评估的生物标志物，也为HCC治疗提供了潜在分子靶点。