强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是脊柱关节炎中最常见的类型，全球发病率为0.1%~1.4%^[1]。AS是一种免疫介导的慢性炎症性疾病，主要累及骶髂关节和中轴脊柱关节，因其逐渐强直，最终导致关节功能障碍和功能丧失。AS主要病理特点为脊柱关节和附着点慢性炎症^[2]及新骨形成导致脊柱融合^[3]，因此认识慢性炎症与骨形成之间的联系，对于异常新骨形成的治疗至关重要。人类白细胞抗原B27（human leucocyte antigen B27，HLA-B27）与AS发病关系密切^[4]，但AS并非由单一遗传因素引起，而是多种遗传因素共同作用所致。随着高通量测序技术的发展，研究者们逐渐认识到非编码RNA在疾病的发生、发展中具有重要的调控作用。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α抑制剂的治疗虽然能够有效控制AS炎症相关症状，但其能否减缓影像学进展尚不明确，因此需要进一步探求AS骨形成的通路和发生机制，寻找更加有效的治疗靶点。Wnt蛋白在正常骨稳态特别是成骨细胞新骨形成中发挥着重要作用^[5]。越来越多的证据表明Wnt通路在一定程度上受炎症调控，该通路的异常调节是AS新骨形成的一个关键因素^[6-7]。本文主要就近年来Wnt/β-catenin通路在AS发病机制中的研究进展作一综述。

Wnt是一种相对分子质量为40 000的蛋白质^[8]，目前已知的主要有19种Wnt蛋白^[9]。Wnt蛋白的翻译在内质网中进行，同时被内质网结合的O-酰基转移酶棕榈酰化^[10]；其受体是7次跨膜卷曲蛋白和共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）^[11]。分泌的Wnt蛋白通过释放到细胞外发挥作用，也可以与硫酸肝素表面分子结合后局部保留下来，参与调节各种细胞活动。

Wnt信号通路分为典型信号通路和非典型信号通路。典型Wnt信号通路调控β-catenin的表达及其亚细胞定位。在Wnt蛋白缺失时，β-catenin通过泛素依赖的蛋白酶体降解而保持较低水平，此过程受轴抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、腺瘤性结肠息肉（adenomatous polyposis coli，APC）蛋白、酪蛋白激酶1α（casein kinase 1α，CK1α）和糖原合成激酶3α/β（glycogen synthase kinase 3α/β，GSK3α/β）组成的破坏复合物的控制^[12]。这种破坏复合物通过磷酸化β-catenin上的特定氨基酸残基发挥作用^[13]。简单地说，在Wnt蛋白缺失时，新合成的β-catenin在构成上是蛋白水解的靶点，而Wnt通过抑制这种降解而发挥作用。Wnt蛋白与富含半胱氨酸结构域的卷曲蛋白和LRP5/6同时形成复合物，从而形成双受体复合物。受体的胞内部分传递结合信息，LRP5/6胞内尾部与Axin结合，导致β-catenin与其蛋白复合物分离，激活β-catenin信号转导^[5]。β-Catenin向细胞核移位，通过结合和调节T细胞因子/淋巴增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）家族的活性起转录共激活作用^[14]。Wnt/β-catenin靶基因与细胞谱系或类型有关^[15]，但常见的靶点包括通路的正负反馈调控基因、参与细胞周期进程的基因和参与干细胞功能的基因。研究发现TNF-α可以激活Wnt/β-catenin信号通路^[16]。非典型的Wnt信号通路独立于β-catenin，作用于Rho家族鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatase，GTPase），控制细胞极性和细胞运动，或通过异三聚体G蛋白作用控制Ca²⁺信号^[17]。

硬化蛋白和Dickkopf（Dkk）家族的Dkk1可与Wnt共受体LRP5/6结合，抑制Wnt信号转导^[18]。Dkk是一个富含半胱氨酸的蛋白质家族，至少由4个成员组成：Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4。其中，对Dkk1的研究最为广泛，目前研究发现Dkk1是Wnt信号通路的天然抑制剂^[19]。

AS的主要特点是骨赘形成导致脊柱融合，同时伴发脊柱骨质疏松，从而增加椎体骨折的风险。虽然目前尚不完全了解AS的发病机制，但Wnt信号通路是AS发展过程中的一个关键途径，它可以通过诱导间充质细胞分化为成骨细胞参与骨形态发生和骨代谢稳态^[20]，可能在AS新骨形成中发挥重要作用。

关于炎症与异位新骨形成的关系，目前主要有两种理论。一种理论认为，未知刺激引发的炎症促进骨分解过程。当炎症波动并被间歇性抑制时，骨分解过程被一种以过度反应性成骨为特征的骨合成反应所取代；另一种理论认为炎症和骨形成不耦合，并且独立触发激活炎症和基质细胞^[21]。基质细胞的激活导致骨形成，抑制炎症甚至可能促进骨形成（“TNF制动假说”）^[22]。最近一项研究揭示了这两种理论之间的联系。该研究采用体外细胞培养系统，利用TNF在炎症微环境中诱导成骨性Wnt蛋白的表达。在炎症水平相对较低的某一疾病阶段，低强度的TNF刺激诱导骨形成部位Wnt蛋白的持续高表达；随后，Wnt诱导的成骨以不依赖炎症的方式发生；当炎症水平相对较高时，TNF水平升高可诱导多种细胞因子如Dkk1的表达，并对骨结构产生分解作用，从而克服成骨分子的合成效应；当炎症程度再次降低时，骨形成期又恢复。结果表明炎症是新骨形成的起始因素和制约因素，分解-合成代谢周期由炎症的强度驱动；促炎细胞因子诱导的成骨分子是炎症与新骨形成的关键环节，而炎症强度则是骨形成的开关^[23]。

“TNF制动假说”是为了解释在临床环境中TNF阻断后新骨形成的增强作用。基于上述结果研究人员推测有效的抗TNF治疗会显著降低TNF水平，但没有达到正常人群的基线水平^[23]。这种降低的TNF水平不再对骨形成产生抑制作用；相反，它增加了成骨性Wnt蛋白的表达，并发挥骨诱导作用。这一发现可能在一定程度上解释了“TNF制动假说”，但如果非甾体类药物和TNF阻断剂自疾病早期开始长期使用，则可能抑制炎症强度，从而破坏对成骨分子的诱导作用。这一发现说明了治疗时间窗和持续时间的重要性^{[22, 24]}。

Wnt信号传递的复杂性在于不同的Wnt蛋白似乎具有相同的功能，如Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b、Wnt10b、Wnt11和Wnt16b均具有成骨作用^[23]。研究发现成骨细胞中Wnt1的失活会引起小鼠严重的骨质疏松症和自发性骨折；相反，成骨细胞中Wnt1的条件性表达可迅速增加成骨细胞的数量和功能，使发育中的幼鼠、成年小鼠和老龄小鼠的骨量迅速增加^[25]。与现有双受体复合物模型^[5]相反，骨量调节过程中传递细胞外Wnt信号的共受体LRP5的丢失并没有降低Wnt1的骨合成效应，这直接证明Wnt1功能的发挥不需要LRP5共受体^[25]。研究结果表明，多个骨合成途径可以被连续地靶向以刺激骨形成^[25]。Wnt蛋白在骨形成部位表达，对Wnt信号的抑制能显著抑制新骨形成和后凸形成，提示Wnt信号在脊柱强直进展中发挥关键作用^[23]。

已知miRNA是一类内源性非编码RNA，一般由18~25个核苷酸组成^[26]。自身免疫性疾病中特异性miRNA表达模式的确定以及对miRNA在疾病发病机制中作用的全面认识，使得miRNA不仅可能成为新的分子诊断标志物，而且也是治疗自身免疫性疾病的新途径。近年的研究表明，miRNA对成骨分化上游信号（如骨形态发生蛋白）、成骨分化重要信号通路（如Wnt通路）及成骨分化下游基因具有重要调控作用^[27-29]。其中miRNA-29a主要通过靶向典型Wnt/β-catenin通路来调控成骨细胞的分化，对糖皮质激素引起的大鼠骨质丢失和脆性增加有保护作用，TNF-α对miRNA-29a的表达有调节作用^[30]。2014年一项研究首次报道了AS患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中miRNA-29a的表达增加^[31]。近年研究提示miRNA-29a主要通过靶向β-catenin信号通路抑制剂Dkk1和GSK3β激活β-catenin信号通路，调控TNF-α介导的骨丢失^[32-33]。AS患者韧带组织中miRNA-124表达升高，同时GSK3β的表达受到抑制，进而增强Wnt/β-catenin通路的活性，促进成纤维细胞向成骨细胞分化^[34]。另有研究发现，miRNA-218可通过特异性靶向多种Wnt信号抑制剂[包括硬化蛋白和分泌型卷曲相关蛋白2（secreted frizzled-related protein 2，sFRP-2）]增强Wnt信号和Wnt靶向的甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）分泌，促进破骨细胞的分化和骨破坏^[35]。有趣的是，成骨细胞可吸收miRNA-218，从而抑制Ⅰ型胶原的产生，导致骨形成和骨吸收之间的进一步失衡^[35]。上述研究为探寻AS患者炎症环境中骨代谢受损的机制提供了新思路及新的治疗靶点。

研究证明Dkk1可能是AS新骨形成过程中的关键角色^[36-38]。Dkk1通过与LRP5/6形成复合物来抑制Wnt信号，从而使LRP5/6脱离细胞膜^[39]。阻断Dkk1可导致关节炎动物模型中骶髂关节融合^[40]。然而不同研究中Dkk1水平呈现差异性，可表现为表达升高、正常表达、正常表达但部分失能，甚至表达下降。Diarra等^[36]发现类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者功能性Dkk1水平高于健康对照组，而AS患者功能性Dkk1水平降低，表明Dkk1水平与新骨形成之间存在联系。Daoussis等^[41]发现，接受抗TNF-α治疗的AS患者血清Dkk1水平显著高于未接受抗TNF-α治疗的AS患者。尽管血清Dkk1水平升高，但AS患者血清中Dkk1抑制β-catenin易位的能力降低，提示AS患者Dkk1可能不完全发挥功能^[41]。而另一项研究结果显示AS患者髋关节滑膜组织中Dkk1水平下调，通过Wnt/β-catenin信号通路促进成纤维细胞增殖和成骨能力^[37]。最近的一项研究为AS患者Dkk1表达的差异性提供了新证据，该研究结果显示AS患者Dkk1表达水平的矛盾数据可能与血清甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）水平的变异性有关，血清PTH水平是血清Dkk1水平的重要决定因素，可能与AS患者骨受累有关。因此，今后对这一问题的研究还应包括PTH评估，以便进行更全面的评价^[42]。

硬化蛋白也是一种Wnt信号通路抑制剂。检测RA、AS和骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者血清和骨细胞中硬化蛋白的水平，发现AS患者的硬化蛋白水平明显低于RA、OA患者和健康对照者^[43]。另一项研究发现硬化蛋白通过LRP6抑制TNF-α诱导的慢性炎症，除了典型Wnt/β-catenin信号通路，尚不清楚LRP6对其他通路的影响^[44]。此外，成骨细胞中氧传感器脯氨酸羟化酶2（prolyl hydroxylase 2，PHD2）的氧感应通过硬化蛋白的表观遗传负性调控骨量，PHD2的条件性缺失通过沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）依赖性下调硬化蛋白激活Wnt/β-catenin信号，从而增加成骨细胞的数目和活性，同时降低破骨细胞生成和骨吸收^[45]。然而血清硬化蛋白水平与放射学进展、临床活动性或实验室数据之间均无显著相关性^[46]，因此硬化蛋白可能在AS诊断中起重要作用，但仍需要进一步研究证明硬化蛋白与AS疾病活动性和疾病进展的关系，以提供新的治疗策略。

新骨形成是AS的主要病理特点，也是治疗的难点和挑战。炎症强度与新骨形成的关系对AS的临床治疗时机与治疗时间具有重要指导意义，早期持续地将炎症控制在一定范围内可减弱慢性炎症对成骨的诱导作用。对Wnt信号通路抑制剂Dkk和硬化蛋白的研究有利于新型药物的开发，以进一步有效控制AS病情进展。对miRNA靶向Wnt/β-catenin信号通路调控新骨形成的研究使人们对AS的发病机制有了更清晰的认识，也为寻找新的生物标志物提供了可能。此外，代谢组学的深入研究表明肠道微生物及其代谢产物可通过Wnt/β-catenin信号通路调节骨代谢^[47]，但目前仍缺乏对AS的相关研究，这或许为AS新骨形成机制的研究提供了新的方向。Wnt/β-catenin信号通路在AS新骨形成和关节强直过程中发挥重要作用，认识Wnt/β-catenin信号通路在AS新骨形成或强直发生中的分子机制，明确慢性炎症发生、发展与成骨间的联系，有望为AS的治疗提供新的思路，极大地改善疾病预后。