子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性，其发病率在女性常见恶性肿瘤中位居第6位^[1]。研究表明，在子宫内膜癌形成和发展过程中存在缺氧情况，缺氧状态也会严重影响子宫内膜癌的发展^[2]。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是由氧敏感的α亚基和组成型表达的β亚基（也称为芳烃受体核易位蛋白）组成的异二聚体，可通过调节葡萄糖摄取、能量代谢、血管生成、红细胞生成、细胞增殖和凋亡、细胞-细胞和细胞-基质相互作用来调节低氧状态下的细胞功能^[3-4]。研究发现，HIF特别是HIF-1α和HIF-2α与肿瘤的发生、转移和上皮-间质转化有关^[5-6]。

肿瘤转移最常见的方式是通过血液和（或）淋巴结，血管生成对肿瘤生长和转移至关重要。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成因子之一，能够促进新血管和淋巴管的形成^[7]，并增加血管外基质的沉积，为建立新的毛细血管网提供营养^[8]。本研究拟探讨HIF-1α和VEGF在子宫内膜癌中的表达情况及其临床意义。

选择2011年1月至2012年12月在同济大学附属同济医院接受手术治疗的子宫内膜癌患者128例。入选标准：（1）子宫内膜癌的诊断均经术后病理学检查确诊；（2）初次诊断为子宫内膜癌，入院时未接受任何化学治疗或手术治疗；（3）排除临床资料不完整、继发性肿瘤、多器官功能衰竭和多发性肿瘤的患者。通过医院病历查询系统查询宫颈癌患者的一般资料和临床病理学指标。本研究通过同济大学附属同济医院伦理委员会批准。初诊时，128例患者的平均年龄为（58.20±10.36）岁。

获取每例患者的子宫内膜癌组织和癌旁正常组织（距离肿瘤≥3 cm），分别进行液氮冷冻保存和病理组织切片。

将载玻片置于重铬酸钾和浓硫酸混合液中浸泡1 h，然后用流水冲洗载玻片，冲洗后将载玻片浸泡于乙醇中，最后放置于37 ℃温箱中烘干；在铁模具中加入液态石蜡，将组织置于石蜡中进行包埋；将石蜡标本切片，放置于40 ℃温水中浸泡5 min，捞取后于37 ℃恒温箱中烘干；载玻片梯度脱蜡；抗原修复和血清封闭后加入一抗，4 ℃孵育过夜；加入二抗，37 ℃温箱孵育30 min；取出后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3次，每次5 min，擦干后加入SABC，于37 ℃温箱孵育30 min。

自确诊时起，对所有研究对象定期随访，随访间隔为4周。通过面对面访问和查阅患者疾病档案的方式了解患者的疾病进展。随访终止时间为2017年12月31日。总生存期定义为自初诊为子宫内膜癌开始至患者因子宫内膜癌死亡或随访终止的时间，无进展生存期定义为从随访时间开始至患者出现复发、死亡、肿瘤相关并发症或继发第二肿瘤的时间。

在对数生长期，选取生长状态良好的KLE细胞（人子宫内膜癌细胞），铺96孔板，并做好标记；每孔接种细胞1×10⁶个，置于细胞培养箱中培养，并密切观察细胞生长状态。待细胞贴壁生长后，将细胞分为缺氧组和对照组，缺氧组加入160 μL二氯化钴干预液，对照组加入等量的PBS。分别在干预后0、24、48和72 h用酶标仪检测细胞光密度值，拟合曲线并计算标准曲线方程，计算细胞数。

收集各组细胞，裂解后离心取上清，凝胶电泳后转膜，牛奶封闭。加入HIF-1α和VEGF抗体（英国Abcam公司）于4 ℃下孵育过夜，用TBST洗膜；加入二抗室温下孵育1 h；TBST洗膜后进行化学发光反应曝光。

每组收集1×10⁶个细胞于流式管中，用PBS冲洗3次，用75%乙醇涡旋混匀，于4 ℃下避光过夜，次日离心后去除上清，用PBS洗去乙醇，使用7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D，7-AAD）染色，1 h内上流式细胞仪进行检测。

收集各组细胞，用无血清培养液洗3次，计数，配成细胞悬液。在Transwell小室（Transwell BD Matrigel，美国Corning公司）上室中加入100 μL细胞悬液，下室中加入500 μL含有20%胎牛血清的条件培养液，于37 ℃培养箱中孵育20~24 h。取出小室用PBS洗2次，5%戊二醛4 ℃固定；加入0.1%结晶紫，室温染色5~10 min；PBS洗2次，用棉球擦去上表面细胞，在显微镜下观察，取9个随机视野计数，统计结果。

采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示，两组间差异的比较采用独立样本t检验，多组间差异的比较采用单因素方差分析并用Dunnett法或LSD法进行两两比较；不符合正态分布的计量资料以中位数和范围表示。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。检验水准（α）为0.05。

免疫组织化学检测结果表明，HIF-1α和VEGF蛋白在子宫内膜癌组织中的阳性率分别为75.0%（96/128）和64.8%（83/128），癌旁组织中阳性率分别为10.9%（14/128）和20.3%（26/128）。子宫内膜癌组织中2种蛋白的阳性表达率均高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P均＜.05）。

按照免疫组织化学检测结果将研究对象分为HIF-1α蛋白阳性组和阴性组、VEGF蛋白阳性组和阴性组，分析HIF-1α和VEGF蛋白表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系。结果（表 1）表明，HIF-1α蛋白在淋巴结转移阳性、高组织学分级、肿瘤最大径≥4 cm和孕激素受体阳性的患者中阳性率较高（P均＜.05），而与患者的年龄、肌层浸润深度、病理类型、雌激素受体状态和病理分期无明显关联（P＞0.05）；VEGF蛋白在淋巴结转移阳性、高组织学分级、肌层浸润较深、肿瘤最大径≥4 cm、雌激素受体阳性、孕激素受体阳性和高病理分期的患者中阳性率较高（P均＜.05），而与患者的年龄和病理类型无明显关联（P＞0.05）。

表 1 (Tab 1)

表 1 128例子宫内膜癌患者的临床病理特征与HIF-1α和VEGF蛋白表达的关系 n 临床特征 N HIF-1α VEGF 阳性N=96 阴性N=32 P值 阳性N=83 阴性N=45 P值 年龄(岁) 0.503 0.506   ＜50 38 27 11 23 15   ≥50 90 69 21 60 30 淋巴结转移 ＜0.001 ＜0.001   阳性 41 38 3 36 5   阴性 87 58 29 47 40 组织学分级 ＜0.001 0.023   G1 49 46 3 25 24   G2 69 42 27 52 17   G3 10 8 2 6 4 肌层浸润深度 0.548 ＜0.001   无 22 16 6 4 18   浅 77 56 21 53 24   深 29 24 5 26 3 病理类型 0.377 0.827   腺癌 98 75 23 64 34   鳞腺癌 21 16 5 14 7   其他 9 5 4 5 4 肿瘤最大径d/cm 0.018 0.008   ＜4 96 67 29 56 40   ≥4 32 29 3 27 5 雌激素受体 0.690 ＜0.001   阳性 105 78 27 80 25   阴性 23 18 5 3 20 孕激素受体 0.001 ＜0.001   阳性 102 83 19 74 28   阴性 26 13 13 9 17 病理分期 0.888 0.012   Ⅰ期 87 66 21 49 38   Ⅱ期 32 23 9 26 6   Ⅲ期 9 7 2 8 1 HIF-1α:缺氧诱导因子1α; VEGF:血管内皮生长因子

表 1 128例子宫内膜癌患者的临床病理特征与HIF-1α和VEGF蛋白表达的关系

128例子宫内膜癌患者随访28.8~68.2个月，中位随访时间为43.5个月。中位总生存期为28.9个月（10.3~49.2个月），中位无进展生存期为21.2个月（8.3~39.4个月）。HIF-1α蛋白阴性组5年总生存率和5年无进展生存率均高于阳性组，差异均有统计学意义（71.9% vs 31.3%，P＜.05；59.4% vs 17.7%，P＜.05）；VEGF蛋白阴性组患者的5年总生存率与阳性组比较差异无统计学意义（55.6% vs 33.7%，P＞0.05），但5年无进展生存率高于阳性组（48.9% vs 16.9%，P＜.05）。

蛋白质印迹分析结果显示，缺氧组细胞中HIF-1α蛋白、VEGF蛋白的相对表达量均高于对照组，差异均有统计学意义（5.46±1.45 vs 1.12±0.19，P＜.05；3.87±0.32 vs 1.13±0.14，P＜.05）。

细胞增殖实验表明，干预72 h后，缺氧组的细胞数多于对照组，差异有统计学意义（9 783.0±45.6 vs 7 276.0±76.3，P＜.05）。Transwell实验检测结果显示，干预72 h后，缺氧组的穿膜细胞数多于对照组，差异有统计学意义（421.0±16.8 vs 287.0±12.5，P＜.05）。

流式细胞术结果表明，缺氧组细胞在G₀/G₁期的比例低于对照组（34% vs 52%），在S期和M/G₂期的比例高于对照组（S期：46% vs 32%；M/G₂期：20% vs 16%）；同时，缺氧组细胞的凋亡率低于对照组，差异有统计学意义[（4.50±0.03）% vs（8.70±0.14）%，P＜.05]。

血管生成对于实体瘤的生长和转移是必需的，而VEGF是最有效的血管生成介质^[7]。研究发现，胃癌患者术前血清VEGF水平高于对照组，且术前血清VEGF水平与T分期、N分期和TNM分期有关^[9]。抗VEGF抗体联合化学治疗可延长宫颈癌患者的生存期^[10]。HIF是氧敏感的异二聚体转录因子，是细胞适应低氧环境的关键调节因子。研究发现，在小细胞肺癌中，HIF-1α作为一种关键的转录调控因子，调控多种细胞因子如VEGF-A的表达，并促进小细胞肺癌细胞的增殖和血管生成^[11]。Ahluwalia和Tarnawski^[12]提出VEGF是HIF-1α的靶基因，受HIF-1α调控进行转录，促进低氧条件下肿瘤的血管生成进而促进肿瘤转移。

本研究以128例子宫内膜癌患者为研究对象，结果发现癌组织中HIF-1α和VEGF蛋白的阳性表达率高于癌旁组织，且2种蛋白的表达与淋巴结转移、组织学分级、肿瘤大小有关，是肿瘤发生发展的重要因素。进一步通过人子宫内膜癌细胞模拟缺氧环境，观察其侵袭、增殖及凋亡情况，发现缺氧能促进子宫内膜癌细胞增殖和侵袭，抑制细胞凋亡。本研究结果表明HIF-1α、VEGF表达与子宫内膜癌的发生、发展密切相关，VEGF、HIF-1α极有可能诱导癌细胞的浸润、转移，是子宫内膜癌侵袭性生物学行为的标志物之一。

VEGF与各个受体的相互作用是血管生成的关键过程，血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的表达通常局限于血管内皮细胞，被广泛认为是驱动血管生成的主要受体^[13]，且被认为是调节内皮细胞增殖和迁移的关键信号^[14]。本研究未探讨VEGF与其受体的关系，HIF-1α-VEGF-VEGFR途径是否在子宫内膜癌的转移中起重要作用仍需进一步研究。明确HIF-1α和VEGF对子宫内膜癌侵袭、转移的作用机制将为子宫内膜癌的临床治疗奠定基础。