2019, Vol. 40
慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是一种慢性不可逆性疾病，以胰腺实质破坏、炎症细胞浸润及广泛纤维化为主要特征，最终引起胰腺内分泌和外分泌功能不足，严重影响患者的生命质量[1]。胰腺星形细胞（pancreatic stellate cell，PSC）的发现及其分离培养方法的建立，在很大程度上推动了胰腺纤维化的研究进展[2]。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）也被称为分泌型酸蛋白1，广泛表达于人体平滑肌细胞、内皮细胞及骨组织细胞等，参与骨组织矿化与重建。在炎症、肿瘤、免疫性疾病及纤维化疾病等病理状态下，OPN出现异常表达[3-6]；研究还发现OPN在心肌纤维化、肾间质纤维化及肝硬化中扮演重要角色[7-9]。OPN能激活肝星形细胞，使其过表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）及Ⅰ型胶原蛋白（collagen protein Ⅰ，col Ⅰ），并促进肝星形细胞的增殖、迁移及趋化活性，基因剔除OPN表达可减轻四氯化碳、硫代乙酰胺所致的慢性肝损伤及肝纤维化程度[9]。2002年Nakamura等[10]发现OPN在大多数CP患者胰腺组织中表达，特别是有钙化或结石的患者，推测OPN与CP患者发生钙化或结石密切相关。本课题组前期在大鼠CP模型中发现OPN在纤维化的胰腺组织中过表达，并与胰腺纤维化程度呈正相关[11]。本研究旨在探讨OPN对PSC的影响及其可能的机制。
1 材料和方法 1.1 OPN慢病毒过表达载体（OPN-O/E）的构建与验证靶向OPN的慢病毒过表达载体引物序列：上游引物5′-ACT GTC GGG ATC AAC ATG AGA ATT GCA GTG ATT TG-3′，下游引物5′-AAC CAC TTT GTA CAA TTA ATT GAC CTC AGA AGA TG-3′；OPN-O/E购自上海亚载生物科技有限公司。构建步骤简述如下：通过软件设计OPN-O/E引物；以PCR法获取OPN过表达片段；然后进行载体酶切，载体为pLX304-Blast-V5载体，内切酶为Sac Ⅰ和Nhe Ⅰ；酶切载体胶回收，采用LIC连接酶方法连接载体与片段；挑取重组阳性克隆行PCR及测序鉴定；OPN-O/E慢病毒质粒用Lipofectamine 2000（美国Invitrogen Life Technologies公司）转染293T细胞（上海亚载生物科技有限公司），转染72 h后收集培养液上清过滤浓缩；最后测定浓缩液病毒的滴度。阴性对照（OPN-control）也采用同样的方法构建。PSC为HPaSteC细胞系，购自美国Sciencell公司，由海军军医大学（第二军医大学）长海医院消化内科实验室保存，常规培养、传代。取对数生长期的PSC，以每瓶1.5×105个细胞接种于细胞培养瓶中，培养24 h后分为OPN-O/E组及对照组。在培养液中加入病毒原液（感染复数为50）及聚凝胺（8 μg/mL左右，上海亚载生物科技有限公司），轻轻混匀后加入对应细胞培养瓶中，24 h后更换完全培养液；转染48 h后观察荧光表达，并收集细胞提取RNA进行验证。用TRIzol试剂（美国Invitrogen Life Technologies公司）提取总RNA，采用反转录试剂盒（美国Fermentas公司）反转录获得cDNA，应用实时荧光定量PCR法检测OPN-O/E组及对照组OPN mRNA水平。引物序列由上海亚载生物科技有限公司合成，OPN上游引物：5′-GAA GTT TCG CAG ACC TGA CAT-3′，下游引物：5′-GTA TGC ACC ATT CAA CTC CTCG-3′；GAPDH（内参照）上游引物：5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′，下游引物：5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。PCR反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 7 s、57 ℃ 10 s、72 ℃ 15 s 45个循环。经仪器自带软件获取Ct值，以对照组表达量为1，通过公式2－ΔΔCt计算OPN mRNA的相对表达量。
1.2 细胞增殖活性检测采用CCK-8试剂盒（美国BBI Life Sciences公司）进行。用多聚赖氨酸（美国Sciencell公司）处理96孔板，将PSC铺进96孔板内，每孔约3 000个细胞，次日进行慢病毒转染，转染48 h后更换培养液，同时在OPN-O/E组及对照组每孔加入10 μL CCK-8试剂，在37 ℃细胞培养箱中避光孵育1 h，用酶标仪检测各组450 nm波长处的光密度值。
1.3 细胞趋化活性检测用多聚赖氨酸处理Transwell小室（美国Corning公司，货号354480）。将OPN-O/E组及对照组细胞消化，离心去上清后加入无血清培养液重悬，将细胞密度调至1×106/mL，取200 μL细胞悬液加入小室上层，下层加入完全培养液，放回培养箱。24 h后取出小室，用PBS清洗后加入4%甲醛固定30 min，用结晶紫染色30 min，磷酸盐缓冲液清洗后用棉签擦除上室内多余的细胞，随机选5个100倍视野拍照计数。
1.4 蛋白质印迹法检测收集细胞加入裂解液及蛋白酶抑制剂，提取总蛋白，用BCA法测定蛋白质浓度（BCA试剂盒购于上海碧云天公司）。取50 μg蛋白行常规蛋白质印迹分析，最后用ECL化学发光法显影（ECL显影液购于美国Millipore公司），采用ImageJ软件计算灰度值，以各组目的蛋白与Tubulin（内参照）灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。独立实验重复3次。OPN抗体（稀释比例为1:1 000）、α-SMA抗体（1:300）均购自英国Abcam公司，Tubulin抗体（1:5000）购自上海亚载生物科技有限公司、PI3KC抗体（1:1 000）、p-PI3KC抗体（1:1 000）、Akt抗体（1:1 000）、p-Akt抗体（1:1 000）均购自美国CST公司，辣根过氧化物酶标记二抗（1:5 000）购自英国Abcam公司，Akt抑制剂LY294002（10 μmol/L、50 μmol/L）购自美国CST公司。
1.5 统计学处理采用SPSS 18.0软件进行数据处理。呈正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 OPN-O/E转染效果的验证用慢病毒质粒转染PSC 48 h后，对照组细胞贴壁呈条索状，而OPN-O/E组细胞逐渐呈多角形及星形（图 1），但两组之间荧光表达率差异并无统计学意义[（78.57±2.87）% vs（77.77±1.84）%，t＝0.41，P＝0.705]。实时荧光定量PCR结果显示OPN-O/E组OPN mRNA的相对表达量为2.08±0.18，与对照组（1.00±0.10）相比差异有统计学意义（t＝－9.07，P＝0.001），证实所构建的慢病毒载体能有效上调OPN的表达。
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图 1 OPN慢病毒过表达载体（OPN-O/E）转染PSC 48 h后白光及荧光显微镜下的表现 Fig 1 PSC transfected with OPN lentiviral overexpression vector (OPN-O/E) under white light and fluorescence microscope OPN: Osteopontin; PSC: Pancreatic stellate cell. Original magnification: ×200 |
2.2 OPN过表达对PSC增殖活性、趋化活性的影响
采用CCK-8实验检测细胞增殖活性，结果显示上调OPN表达后PSC增殖活性增加，OPN-O/E组与对照组的光密度值分别为1.04±0.03与0.59±0.04，两组差异有统计学意义（t＝－17.78，P＜0.01）。上调OPN表达后PSC趋化活性也增加（图 2），OPN-O/E组和对照组穿过小室的细胞数分别为960.00±76.47、589.33±88.79，两组差异有统计学意义（t＝－4.79，P＝0.017）。
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图 2 骨桥蛋白过表达对PSC趋化活性的影响 Fig 2 Effect of osteopontin overexpression on chemotactic activity of PSC PSC: Pancreatic stellate cell; OPN-O/E: Osteopontin lentivirus overexpression vector. Original magnification: ×200 |
2.3 上调OPN表达对PSC活性及PI3K/Akt信号通路的影响
OPN-O/E组OPN蛋白的相对表达量较对照组增加（4.42±0.15 vs 1.54±0.13，t＝－25.45，P＜0.01）。OPN-O/E组α-SMA蛋白的相对表达量高于对照组（4.35±0.26 vs 1.21±0.10，t＝－19.46，P＜0.01），提示上调OPN表达可诱导PSC转为活化状态。上调OPN表达后p-PI3K及p-Akt蛋白的相对表达量也较对照组增加（2.00±0.26 vs 1.12±0.36，t＝－3.43，P＝0.027；1.47±0.11 vs 0.52±0.04，t＝－14.60，P＜0.01）；而上调OPN表达后PI3K与Akt蛋白的相对表达量与对照组相比无明显改变（3.85±0.27 vs 3.75±0.41，t＝－0.37，P＝0.727；1.20±0.08 vs 1.23±0.06，t＝0.46，P＝0.667）。见图 3。
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图 3 上调OPN表达对PSC α-SMA及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 Fig 3 Effect of OPN up-regulation on expression of α-SMA and PI3K/Akt pathway-related proteins in PSC Western blotting results. OPN: Osteopontin; PSC: Pancreatic stellate cell; α-SMA: α-Smooth muscle actin; OPN-O/E: Osteopontin lentivirus overexpression vector; p-PI3KC: Phosphorylated-PI3KC; p-Akt: Phosphorylated-Akt |
2.4 Akt抑制剂对OPN过表达介导的PSC活化的影响
转染OPN-O/E 48 h后加入不同浓度的Akt抑制剂LY294002，以加入等体积的磷酸盐缓冲液为对照，处理1 h后检测α-SMA、p-Akt及Akt蛋白的表达。蛋白质印迹法结果（图 4，表 1）显示，无论LY294002的浓度是10 μmol/L还是50 μmol/L均可有效抑制α-SMA及p-Akt蛋白的表达，与OPN-O/E组相比差异均有统计学意义（α-SMA：t＝19.90、45.06，P均＜0.01；p-Akt：t＝16.81、22.08，P均＜0.01）；而Akt蛋白的表达则无明显变化（t＝－0.90、－0.35，P均＞0.05）。
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图 4 Akt抑制剂LY294002对OPN过表达PSC中α-SMA、p-Akt及Akt蛋白表达的影响 Fig 4 Effect of Akt inhibitor LY294002 on expression of α-SMA, p-Akt and Akt in OPN overexpression-PSC Western blotting results. OPN: Osteopontin; PSC: Pancreatic stellate cell; α-SMA: α-Smooth muscle actin; p-Akt: Phosphorylated-Akt; OPN-O/E: Osteopontin lentivirus overexpression vector |
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表 1 Akt抑制剂LY294002处理后PSC中α-SMA、p-Akt及Akt蛋白的相对表达量 Tab 1 Relative expression of α-SMA, p-Akt and Akt in PSC treated with Akt inhibitor LY294002 |
3 讨论
OPN是一种分泌型糖蛋白，作为细胞因子及细胞外基质蛋白其参与了组织重建、骨重建、炎性渗出及肿瘤转移等生理及病理过程[6]。研究发现，OPN在瘢痕及纤维化组织（如肾纤维化组织、肝纤维组织、肺纤维化组织等）过表达，且与机体的促纤维化作用密切相关[10, 12-13]。有关OPN在CP的胰腺纤维化中的作用研究甚少，Rychlíková等[13]发现CP患者OPN的浓度高于2型糖尿病患者及正常人，特别在伴有钙化和结石的患者中。PSC与肝星形细胞同源，主要位于胰腺腺泡、导管及血管周围，静止状态时呈条索状或纺锤状，细胞质富含维生素A脂滴，一旦被激活其形态向多角形或星形转变，维生素A脂滴消失，取而代之表达特异性标志物α-SMA，增殖、迁移活性等也明显提高，释放多种细胞因子及生长因子，合成大量细胞外基质成分，最终导致胰腺纤维化[14]。本实验结果显示，上调OPN不仅可以激活PSC表达α-SMA，而且促进其增殖及趋化活性，进一步证实OPN可以通过激活PSC参与胰腺纤维化的形成。PI3K/Akt信号通路是参与PSC活化的重要通路之一，在血小板源性生长因子、乙醇、乙醛等公认的PSC激动剂激活PSC的过程中PI3K/Akt信号通路均起主要作用。PI3K/Akt信号通路还参与了OPN下游的重要作用机制。有研究表明OPN通过激活PI3K/Akt信号通路促进瘦素介导的肝纤维化[15]、上调血管生长因子表达[16]及促进肿瘤新生血管的形成[17]。本实验结果显示，上调OPN表达后PI3K/Akt信号通路中p-PI3K及p-Akt的表达增加，给予10 μmol/L或50 μmol/L Akt特异性抑制剂LY294002处理后，上调OPN表达引起的α-SMA及p-Akt过表达被抑制，表明OPN可以通过激活PI3K/Akt信号通路介导PSC的活化。综上，我们认为OPN通过激活PI3K/Akt信号通路介导PSC活化，进而参与了胰腺纤维化。
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