膜联蛋白(annexin, Anx)是一类Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白, 具有可逆性结合磷脂膜和Ca²⁺的能力。膜联蛋白家族是个庞大的蛋白家族, 其家族成员广泛分布于动植物的各种组织和细胞中, 目前被确认的已经超过500种, 人们把其中最常见于脊椎动物体内的12种列为A亚类^[1]。AnxA2是膜联蛋白家族的重要成员, 其功能涉及胞吞、胞吐、细胞膜构成、肌动蛋白重组、细胞信号转导、蛋白组装、转录和新生血管生成以及DNA复制与修复等, 其在大多数细胞和组织中均有表达, 并可与多种配体结合发挥多种功能。AnxA2的多功能受到多个步骤的复杂调节, 包括其与配体的结合、细胞定位和翻译后修饰等, 而蛋白质磷酸化是目前最受关注的AnxA2翻译后修饰方式^[2]。近年来研究发现在肿瘤细胞外泌体中也存在AnxA2表达。本文重点讨论了3个主要磷酸化位点(Ser11、Ser25和Tyr23)对AnxA2功能调控的影响以及其在外泌体中的研究进展。

AnxA2具有高度保守的羧基端, 包括4个含有70个氨基酸的同源重复序列(Ⅰ~Ⅳ结构域), 形成了具有一个凹面和一个凸面的弯曲结构, 凹面与自身氨基端结构域或其他细胞质蛋白质结合, 凸面含有Ca²⁺结合位点; AnxA2的氨基端位于核心结构的凹侧, 含有S100A10二聚体结合位点、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)及Src家族激酶的磷酸化调节位点。AnxA2主要以两种形式存在:单体结构和与S100A10(p11)共同构成的异源四聚体结构^[3-4]。在异源四聚体结构中, AnxA2可以抑制S100A10泛素化, 从而阻断其被蛋白酶降解^[5]; 同时, S100A10也可调控AnxA2的功能, 如增强其对脂质的亲和力、降低其与细胞膜相互作用时对Ca²⁺的依赖程度等^[3]。因此, AnxA2-S100A10复合物与其在细胞膜上的定位有关。

蛋白质磷酸化是最常见的翻译后修饰方式, 是指将磷酸基从ATP上转移到蛋白质的丝氨酸(serine, Ser)、酪氨酸(tyrosine, Tyr)等多种氨基酸残基上的过程。磷酸化和去磷酸化对于蛋白质功能的发挥起着关键作用, 可以改变蛋白质的结构和稳定性, 显著影响蛋白质定位、蛋白质活性、蛋白质与配体之间相互作用、蛋白质降解等许多过程。异常磷酸化作用是许多人类疾病的基础^[6], 因此对蛋白质磷酸化的研究具有重大意义。

在人体中, 已被报道的AnxA2磷酸化位点多达45个, 其中最主要的3个磷酸化位点是Ser11^[7]、Ser25^[8]和Tyr23^[9]。目前已经确认Ser25和Tyr23位点的磷酸化均对AnxA2的功能调控有显著影响, Ser25位点磷酸化可促进AnxA2与细胞膜的结合、细胞外分泌及AnxA2与mRNA的结合, Tyr23位点磷酸化可影响细胞形态、促进细胞运动和细胞外分泌; 而对于Ser11位点的磷酸化, 目前仅有体外实验研究了其对AnxA2的功能调控的影响, 包括干扰离子通道的正常功能、止血的正常过程、胞外纤维蛋白原溶解等^[2]。

AnxA2是PKC的重要底物^[4], 研究报道在体外AnxA2可通过蛋白激酶A实现磷酸化^[10]。PKC诱导的AnxA2磷酸化位于Ser25位点, 但在体外实验中也曾发现Ser11位点的高度磷酸化^[2]。PKC通过诱导AnxA2的Ser11位点及Ser25位点磷酸化影响其与细胞膜结合的特性。研究显示AnxA2能够募集和连接分泌颗粒, 并连接颗粒与细胞膜而完成胞吐作用^[11]。在嗜铬细胞的分泌过程中, AnxA2的Ser磷酸化是重要的一环。用尼古丁刺激嗜铬细胞之后, AnxA2会转移到细胞膜下方的特定区域, 并通过PKC使Ser磷酸化, 随后嗜铬颗粒及细胞产生的儿茶酚胺均被释放至细胞外^[12]。体外实验还表明, AnxA2的Ser磷酸化不会影响其与脂质的Ca²⁺依赖性结合, 但能降低AnxA2对Ca²⁺的敏感性, 故只有当Ca²⁺浓度达到更高水平时, AnxA2才可以有效聚集嗜铬颗粒和脂质^[13]。此外, AnxA2的Ser磷酸化只会影响细胞外分泌过程中颗粒的数量, 但不影响整个过程的动力学, 因此, AnxA2的主要作用似乎是聚集和连接分泌颗粒, 而Ser磷酸化可促进AnxA2与细胞膜的结合并维持正常的细胞外分泌功能^[12]。

尽管现在并没有直接证据表明在体内存在Ser11位点磷酸化的AnxA2, 但在体外实验中对其依然有广泛的研究^[7], 特别是在AnxA2和S100A10之间的相互作用方面^[13-14]。AnxA2的Ser11位点磷酸化可以抑制AnxA2-S100A10异源四聚体的形成, 而异源四聚体是AnxA2移动至细胞表面并顺利定位的必要前提, 也是血浆纤溶酶原和组织纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator, tPA)的共同受体^[15]。异源四聚体中的AnxA2可促进纤溶酶原转化为纤溶酶, 从而加速纤维蛋白溶解^[16]; 而纤溶酶又可间接激活PKC, PKC则通过反馈机制来诱导细胞内AnxA2的Ser11位点磷酸化, 以有效抑制异源四聚体的形成, 阻止AnxA2向细胞表面移位以及纤溶酶的进一步生成^[10]。因此, AnxA2的Ser11位点磷酸化可明显干扰纤维蛋白溶解。

AnxA2的Ser11位点磷酸化还影响着AnxA2在止血过程中的功能。在第二信使cAMP和蛋白激酶A的作用下, Ser11位点磷酸化的AnxA2被脱磷酸化, 并与S100A10形成异源四聚体^[14]。只有当完整的异源四聚体存在时, Weibel-Palade小体才可以顺利进行胞吐作用, 从而促使人脐静脉内皮细胞分泌止血过程中的关键因子--血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)^[14]。因此, AnxA2的Ser11位点磷酸化可干扰正常的止血过程。

Ser11位点磷酸化的AnxA2去磷酸化后与S100A10形成的异源四聚体还与维持肠上皮与气道上皮细胞离子通道功能有关^[10]。囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)必须与异源四聚体结合才能在细胞表面作为氯离子通道发挥正常功能^[17]。因此, AnxA2的Ser11位点磷酸化可干扰细胞离子通道的正常功能。

AnxA2与mRNA的结合位点位于其羧基端Ⅳ结构域^[18], 该结合位点中没有目前熟知的RNA结合模序。研究发现有数个与AnxA2结合的mRNA序列定位在其3′端非翻译区, 而这个区域还包含若干定位元件, 提示AnxA2参与调节mRNA的定位^[19]。有学者发现, 在位于细胞核周区的信使核糖核蛋白体(messenger ribonucleoprotein, mRNP)复合物中有Ser25位点磷酸化的AnxA2富集现象, AnxA2的Ser25位点磷酸化促进了其与非多聚体mRNA的关联^[20]。

只有当Ca²⁺存在的前提下, AnxA2才会与AnxA2 mRNA及c-myc mRNA结合, 提示Ca²⁺诱导了AnxA2的构象变化, 使其暴露了mRNA结合位点^[18]。AnxA2的Ser25位点磷酸化能够在Ca²⁺非依赖方式下增强其与AnxA2 mRNA 3′端非翻译区的结合, 这表明Ser25位点磷酸化稳定了AnxA2的蛋白质构象, 这种构象使AnxA2更易与mRNA结合位点相结合^[21]。

AnxA2不仅可被Ser磷酸化, 包括胰岛素受体^[22]在内的许多受体的酪氨酸激酶被活化后也可以使AnxA2 Tyr磷酸化。研究发现AnxA2的Tyr磷酸化可以引起肌动蛋白中的微丝重新排列, 提高细胞骨架的可塑性, 改变细胞形态, 进而促进细胞运动^[23]。用胰岛素刺激仓鼠胚肾细胞之后, 细胞内的AnxA2 Tyr位点立即被磷酸化并激活Rho信号通路, 从而触发外周肌动蛋白聚集, 导致细胞形态发生变化并减弱细胞黏附, 使细胞更容易扩散^[24]。Tyr23位点磷酸化的AnxA2还可激活丝切蛋白, 从而诱导Madin-Darby犬肾细胞伸出旁支且呈离散分布^[25]。Cui等^[26]发现在肝癌细胞中, CD147分子与AnxA2之间的相互作用抑制了Src对AnxA2的Tyr23位点磷酸化, 这样不仅削弱了细胞内Rho信号通路的活性并使细胞皱缩, 而且进一步激活了Rac信号通路; 通过这种机制, CD147分子可以促使肝癌细胞发生上皮间质转化, 从而促进肝癌细胞的迁移和扩散。Tyr23位点磷酸化的AnxA2除了影响细胞形态学^[24-25], 还可影响活化的Src在细胞膜上的定位过程^[27]。上述研究表明, AnxA2的Tyr23位点磷酸化可影响细胞形态, 促进细胞变形运动和上皮细胞的间质转化, 削弱细胞间黏附并促进其扩散与侵袭。

研究发现, 尼古丁的刺激可以触发嗜铬细胞内AnxA2迅速边集并且被Tyr23位点磷酸化, Tyr23位点磷酸化的AnxA2与细胞膜中磷脂酰丝氨酸和磷酸的结合能力明显增强, 但其与肌动蛋白的结合能力却被削弱^[28]。在分泌颗粒与细胞膜连接的阶段, AnxA2的Tyr23位点磷酸化可明显影响肌动蛋白微丝的重排, 但对于分泌颗粒与细胞膜连接的具体效果尚不明确^[28]。此外, AnxA2的Tyr23位点磷酸化也是形成细胞膜微区的必要步骤^[28]。这些结果表明, AnxA2的Tyr23位点磷酸化与否对嗜铬细胞的胞吐过程至关重要。

近年研究发现AnxA2可大量聚集在肿瘤细胞的外泌体中, 如在致癌基因H-Ras诱导Madin-Darby犬肾细胞癌变的过程中, 细胞释放的外泌体中AnxA2水平明显加倍^[29]; 在多形胶质母细胞瘤细胞释放的外泌体中, AnxA2是含量最丰富的蛋白, 且编码AnxA2的mRNA被认为是miRNA-1发挥作用的直接靶点^[30]。外泌体中AnxA2的磷酸化对其功能调控的潜在影响也成为比较热门的课题。活性氧(reactive oxygen species, ROS)在肿瘤中发挥着重要作用, 过度累积的ROS会引起细胞的氧化应激反应, 这与肿瘤的发病机制密切相关^[31]。ROS包括羟基、烷氧基、超氧阴离子、单线态氧和过氧化氢^[32]。在过氧化氢的诱导下, AnxA2会随着细胞的氧化应激而大量表达。在大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)中, 过氧化氢可诱导细胞核内被磷酸化的AnxA2快速且短暂地去磷酸化, 却促进细胞质中AnxA2发生Tyr23位点磷酸化, 且伴随肌动蛋白的重构及细胞形态的改变^[33]。此外, 过氧化氢还刺激PC12细胞释放大量外泌体, Tyr23位点磷酸化的AnxA2也被包含在外泌体中, 进而被释放至细胞外^[33]。有研究进一步发现, 如果用这些外泌体孵育PC12细胞2 h, 再将其与未经处理的PC12细胞均暴露在过氧化氢中15 min后, 经外泌体孵育后的细胞质中Tyr23位点磷酸化的AnxA2表达量较对照组增加了约1倍^[34]。这意味着从应激细胞中分离出的外泌体也可向细胞传递保护信息, 从而提高细胞对过氧化氢的耐受程度, 以此提高细胞生存率^[34]。

AnxA2磷酸化通常与细胞的转移和侵袭有关。在正常肝脏和慢性肝炎组织中几乎检测不到AnxA2, 但在肝癌尤其是低分化肝癌中, 总AnxA2和Tyr23位点磷酸化的AnxA2的表达量均显著升高^[35]。如前所述, Tyr23位点磷酸化的AnxA2可通过参与细胞膜附近的肌动蛋白微丝重排, 改变细胞形态和运动, 使细胞更易扩散; 而CD147分子抑制AnxA2的Tyr23位点磷酸化后可激活Rac信号通路, 通过促使上皮间质转化促进肝癌细胞的扩散^[26]。此外, Ser11位点磷酸化的AnxA2去磷酸化以及其与S100A10的结合都被认为是AnxA2在细胞外表面定位的必要条件, 而细胞外定位的AnxA2可高效介导tPA与纤溶酶原的结合, 使纤溶酶原转化为纤溶酶的效率提高数十倍, 大量的纤溶酶不仅可以迅速降解细胞外基质, 还有效地激活基质金属蛋白酶, 从而对乳腺癌细胞的增殖和迁移侵袭产生显著的促进作用^[36]。

Ser11位点磷酸化的AnxA2的去磷酸化与气道上皮和肠上皮中CFTR^[17]和瞬时受体阳离子通道亚家族Ⅴ成员6(transient receptor potential cation channel, subfamily Ⅴ, member 6;TRPV6)^[10]离子通道的正常功能有关, 因此可对上皮功能产生影响。上皮细胞中离子分泌和再吸收之间的平衡决定了呼吸道和肠道表面液体层的高度, 进而驱动黏液、液体和细菌离开呼吸道和肠道, 从而避免大量呼吸道及消化道疾病的产生。Ser11位点磷酸化的AnxA2阻碍异源四聚体的组成, 故无法与CFTR结合, CFTR的功能则被显著减弱, 受其调控的氯离子通道失活, 引起黏膜上皮细胞的电解质跨膜转运障碍, 最终导致囊性纤维化^[17]。此外, AnxA2的Tyr23位点磷酸化有助于维持肾小管上皮细胞中钠钾泵的正常功能, 钠钾泵的功能减弱会引起大量盐分的流失, 严重影响体内电解质稳态, 而钠钾泵的过度活跃又可能引起高血压^[37]。

AnxA2磷酸化可明显影响AnxA2在细胞外分泌过程中的功能, 包括聚集分泌颗粒、连接颗粒与细胞膜及促进颗粒的释放等。分泌颗粒与细胞膜融合及颗粒内容物的释放是细胞迁移、创伤修复、神经传递、激素分泌等多种细胞功能的基础过程, 故AnxA2的磷酸化对神经内分泌过程也有着极为重要的影响^[11]。在人体中, 嗜铬细胞是肾上腺素产生和释放的主要来源, 决定着儿茶酚胺的释放。嗜铬细胞瘤是较常见的神经内分泌肿瘤, 可由于自身分泌过多的儿茶酚胺而引发头痛、大汗和心动过速等症状, 导致使患者心率增快, 体循环阻力增大, 静脉顺应性降低, 进而导致可危及生命的心血管并发症^[38]。目前普遍认为, AnxA2的磷酸化与嗜铬细胞瘤的发病密切相关, 但具体机制仍有待进一步研究。

AnxA2-S100A10异源四聚体可有效促进纤溶酶的产生, 降解细胞外基质^[16]。有学者发现被Tyr23位点磷酸化的AnxA2抗体孵育过的人脐静脉内皮细胞的管样形成能力明显下降^[39]。此外, 在视网膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)的发病机制中, AnxA2的磷酸化也发挥着重要影响。当AnxA2-S100A10异源四聚体在视网膜血管内皮细胞膜内表面定位后, Src诱导AnxA2的Tyr23位点磷酸化可有效引导异源四聚体转移至细胞外表面, 类似其在肿瘤细胞中产生的影响, 异源四聚体作为纤溶酶原和tPA的细胞表面受体, 在高效介导纤溶酶原与tPA后极大提升了纤溶酶的产生效率, 进而迅速降解血管内皮细胞外基质并诱发RNV, 最终导致包括糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变等在内的致盲性眼病^[40]。

AnxA2为一种多功能蛋白, 其功能和与配体之间复杂的相互作用成为众多学者研究的对象, 而AnxA2的磷酸化对其功能调控的诸多影响更成为热点话题。Ser11、Ser25和Tyr23是最主要的3个磷酸化位点。AnxA2的Ser磷酸化主要影响其与分泌颗粒的聚集和连接, Ser11位点磷酸化可影响其与S100A10的结合, Ser25位点磷酸化可影响与mRNA的结合; 而AnxA2的Tyr23位点磷酸化主要影响其在肌动蛋白动力学中的作用。3个位点磷酸化作用既有区别又紧密联系且彼此影响, 在不同的生理病理过程中可表现为相互协同或相互拮抗, 从而使AnxA2发挥强大而广泛的功能。近年来在肿瘤细胞外泌体中发现大量磷酸化的AnxA2, 对AnxA2磷酸化的研究范围也从细胞内拓展至细胞外。除肿瘤学科外, 内分泌、消化、眼科等众多学科也纷纷加入研究AnxA2及其磷酸化的行列, 并获得令人瞩目的成绩, 这也极大地提升了AnxA2及其磷酸化在临床医学中的影响力, 并对目前许多疾病的治疗提供了新的启示。然而, 目前对AnxA2及其磷酸化的研究尚处于初级阶段, 人们关于AnxA2磷酸化的影响及不同位点磷酸化之间的相互作用均还存在争议和疑问, 仍需要进一步深入研究, 而对于研究成果向临床的转化更是任重道远。