2019, Vol. 40
果糖摄入过量可导致肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗等，是2型糖尿病、非酒精性脂肪肝病、心血管疾病的重要危险因素[1]。碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element-binding protein，ChREBP）是调节果糖和脂质代谢的重要转录因子，属于碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸锌指（basic helix-loop-helix-leucine zipper, bHLH-ZIP）转录因子家族成员，能够识别靶基因中的E-box序列。ChREBP本身含有几个不同的功能区，包括位于氨基端的核定位信号、1个多聚脯氨酸区以及位于羧基端与DNA结合的螺旋-环-螺旋/锌指区，其与共作用因子Max样蛋白X（Max-like protein X，MLX）形成异二聚体后才能发挥转录调节作用[2]，参与果糖分解、糖酵解、糖异生、脂质从头合成等代谢通路中许多关键酶的表达调控[3-4]。ChREBP在肝脏组织、脂肪组织、小肠组织、肌肉组织及胰岛β细胞中高表达[5]，其分为ChREBP-α和ChREBP-β两种亚型，能够感受细胞内碳水化合物的变化，调节糖酵解和脂质合成等相关代谢酶的基因转录[6]。在低糖水平时ChREBP-α的表达被抑制，而当细胞内的碳水化合物水平升高时，ChREBP-α则通过转录激活活性更高的ChREBP-β而发挥作用[6]。本实验室前期研究结果表明，锌指蛋白ZBTB20是ChREBP-α的转录激活因子，参与调节肝脏的脂质从头合成[7]。鉴于目前有关ChREBP的功能研究大多是基于全身敲除模型或者腺病毒介导的基因干扰，不同组织中ChREBP的生理功能尚不清楚。本研究拟利用Cre/loxP系统建立ChREBP的条件性基因敲除小鼠模型，为探寻ChREBP的体内功能奠定基础。
1 材料和方法 1.1 主要材料 1.1.1 质粒、菌株与动物含ChREBP基因组的细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆bMQ-164K10购自英国Source BioScience公司。质粒（pL-452、pL-451、pBR322-2S、pBR322-MK）、菌株EL-350和用于提供胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）及用于假孕的C57BL/6J*129S3雌性小鼠[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0010，使用许可证号：SYXK（沪）2017-0012]均由上海南方模式生物研究中心提供。
Flp转基因小鼠、白蛋白（albumin，Alb）启动子调控的Cre转基因小鼠（Alb-Cre小鼠）和野生型C57BL/6J小鼠均引自美国Jax动物公司[8]，在本实验室繁殖饲养[实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2014-0028]。饲养条件：SPF级动物房，室内温度控制在25 ℃，湿度控制在40%~60%，光照周期为12 h光照/12 h黑暗。
1.1.2 试剂BAC DNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司。ES细胞培养所需的DMEM培养液（高糖，ES细胞级）和胎牛血清（ES细胞级）购自美国Gibco BRL公司，遗传霉素（geneticin，G418）、丙氧鸟苷和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）购自美国Sigma公司。兔抗ChREBP多克隆抗体（货号sc-33764）购自美国Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔IgG二抗（货号111-035-003）购自美国Jackson公司，鼠抗β-actin多克隆抗体（货号60008-1-Ig）购自美国Proteintech公司，HRP标记羊抗鼠IgG二抗（货号115-035-003）购自美国Jackson公司。PrimerStar GXL DNA聚合酶为日本TaKaRa公司产品。
1.2 ChREBP打靶载体的构建 1.2.1 敲除外显子的选择为设计条件基因打靶载体，首先分析了小鼠ChREBP基因组的结构特点。ChREBP基因含有17个外显子，其中第8外显子长185 bp，编码氨基端的61个氨基酸；其上、下游两侧的内含子分别为4.5 kb和3.6 kb。据此推测，敲除第8外显子可造成残留下游编码序列的移码，从而达到去除ChREBP蛋白的目的。因此，本研究选择ChREBP基因第8外显子为条件敲除的靶向外显子。
1.2.2 预打靶载体的构建以ChREBP的BAC质粒为模板，利用PCR分别扩增ChREBP基因组DNA的片段A和B，引物序列见表 1。100 μL PCR体系含模板DNA（BAC质粒）2 μL、5×磷酸盐缓冲液20 μL、2 mmol/L dNTP 7 μL、2 mol/L引物4 μL，PrimerStar GXL DNA聚合酶1 μL；用水补足100 μL。反应条件：98 ℃ 52 min；98 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 5 min。将扩增得到的A、B片段分别用HindⅢ/XhoⅠ和XhoⅠ/BamHⅠ双酶切后，同时克隆到pBR322-2S载体的HindⅢ/BamHⅠ位点，获得ChREBP基因组DNA的取获载体pRV-ChREBP。将该载体和BAC克隆转入菌株EL-350，通过细菌内的同源重组[9]，获得含有横跨A、B片段ChREBP基因组DNA的预打靶载体，记为pBR322-ChREBP。
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表 1 ChREBP打靶载体引物序列 Tab 1 Primer sequences of ChREBP targeting vector |
1.2.3 loxP-neo-loxP片段的插入
以含有loxP-neo-loxP基因的质粒pL-452为模板，利用PCR获得包含ChREBP基因组C和D的loxP-neo-loxP基因片段（各长80 bp），引物序列见表 1，然后经过EL-350菌株内的同源重组敲入到上述获得的预打靶载体pBR322-ChREBP中，得到打靶载体pBR322-MK-ChREBP，经限制性内切酶及测序鉴定。将含有pBR322-MK-ChREBP质粒的EL-350菌株经阿拉伯糖诱导Cre重组酶表达，以去除质粒pL-452引入的neo基因，这样在ChREBP的第8外显子上游只保留1个loxP位点。
1.2.4 Frt-neo-Frt片段的插入以含有Frt-neo-Frt基因的质粒pL-451为模板，利用PCR获得包含ChREBP基因组E和F的Frt-neo-Frt片段（各长80 bp），引物序列见表 1，与上述去neo基因的质粒共同转入EL-350菌株，经过同源重组，构建打靶载体pBR322-MK-ChREBP-KO，并经限制性内切酶及测序鉴定。
1.3 ES细胞的基因打靶与筛选 1.3.1 ES细胞培养培养皿以0.1%明胶包被后接种经丝裂霉素C处理的滋养层细胞（每个10 cm盘接种2×106个滋养层细胞），过夜培养后即可接种ES细胞。ES细胞完全培养液为DMEM培养液（含1 mol/L β-巯基乙醇、2 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、50 mg/L链霉素、15% ES级别胎牛血清和1 000 U/mL LIF）。
1.3.2 ES细胞电穿孔DNA转染处于对数生长期的ES细胞加0.125%胰蛋白酶-EDTA消化并计数，加适量磷酸盐缓冲液使细胞密度达到约1.5×107/mL。取0.8 mL上述ES细胞悬液，加入约35 μg经NotⅠ线性化的pBR322-MK-ChREBP-KO质粒DNA，混匀后转移至无菌电穿孔杯中，以240 V、500 μF的电参数进行电穿孔，重新悬浮后平均分配到3个已铺好滋养层细胞的10 cm培养皿中培养。
1.3.3 正负药物筛选ES细胞在电穿孔24 h后换含有选择药物G418（300 mg/L）和丙氧鸟苷（2 mol/L）的培养液进行选择性培养，每天更换培养液，经7~8 d选择性培养，抗性ES细胞长成肉眼可见的克隆时即可进行挑取。
1.3.4 双抗性细胞克隆的挑取与培养挑取抗性克隆放入含有30 μL 0.1%胰蛋白酶-EDTA的96孔板（凹底）中消化约3 min，轻轻吹打，使细胞分散，后转移至96孔培养板中培养，待细胞生长至60%~80%融合后取大部分细胞冻存，剩余细胞继续培养至100%融合后用于提取基因组DNA。
1.3.5 ES细胞同源重组克隆的PCR鉴定在长满ES细胞的96孔板中吸去培养液，每孔加入80 μL裂解液（含1 mg/L蛋白酶K），56 ℃过夜消化后加入无水乙醇，常规提取基因组DNA，溶于100 μL Tris-EDTA缓冲液中。在ChREBP同源重组臂外侧和neo基因中分别设计引物，鉴定打靶载体的5′、3′同源臂与细胞基因组的同源重组情况。引物序列见表 2。所用的DNA聚合酶为PrimeSTAR GXL。反应条件为：98 ℃2 min；98 ℃ 20 s，64 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共35个循环；68 ℃ 2 min。PCR产物大小分别约为3.4 kb和4.9 kb。
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表 2 ChREBP基因型引物序列 Tab 2 Primer sequences for ChREBP genotypes |
1.3.6 ES细胞的囊胚注射及胚胎移植
注射时采用的是无LIF的DMEM完全培养液，每枚囊胚注射15个左右的ES细胞。注射后的囊胚培养于无LIF的DMEM完全培养液中，37 ℃、5% CO2条件下培养1 h左右，然后将注射后的胚胎移植到2.5 d假孕雌鼠（C57BL/6J*129S3小鼠）子宫中，每侧移植8~10枚。
1.4 条件敲除小鼠的繁育与鉴定 1.4.1 首建鼠的繁育及neo基因去除挑选毛色嵌合度＞50%的雄性嵌合鼠与野生C57BL/6J雌鼠交配，获得ES细胞来源的首建鼠。同ES细胞鉴定方法，用PCR方法鉴定阳性杂合子雌鼠。将杂合子小鼠与flp转基因小鼠进行交配，利用flp介导的Frt重组，去除杂合子小鼠基因组中的neo基因表达框；筛选不含neo和flp基因后代小鼠，记为ChREBPflox/+小鼠。
1.4.2 条件敲除小鼠构建将ChREBPflox/+小鼠与肝脏特异性表达的Alb-Cre小鼠交配，最终获得ChREBPflox/flox; Alb-Cre纯合子小鼠。
1.4.3 小鼠基因型鉴定取4周龄小鼠尾巴，提取基因组DNA进行PCR鉴定。针对第8外显子的下游loxP位点设计ChREBP基因型PCR鉴定引物（表 2），可从野生型、重组的等位基因中分别扩增出593 bp和681 bp的PCR产物。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72℃ 5 min。Neo和Cre的基因型鉴定方法参见文献[8]。
1.4.4 小鼠肝脏ChREBP敲除鉴定取4周龄的小鼠肝脏及小肠组织，提取基因组DNA进行PCR鉴定。针对第8外显子设计ChREBP基因型PCR鉴定引物（表 2），可从野生型等位基因中扩增出363 bp的PCR产物，而基因敲除小鼠中由于肝脏中存在一部分非肝脏细胞，只能扩增出较弱的条带。PCR反应条件：95 ℃ 1 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 5 min。
2 结果 2.1 ChREBP打靶载体的构建及鉴定利用ChREBP的BAC克隆和细菌内同源重组，将含ChREBP基因第8、9外显子及两侧部分内含子的基因组DNA克隆至含有负性选择标志基因胸苷激酶蛋白（thymidine kinase，TK）表达元件的pBR322-2S质粒，得到预打靶载体pBR322-ChREBP。进一步通过PCR和细菌内同源重组，在该载体的ChREBP基因第8外显子上游引入loxP位点，在其下游插入Frt-neo-Frt-loxP元件，从而构建成ChREBP的条件打靶载体pBR322-MK-ChREBP-KO（图 1），并经限制性内切酶的酶切分析及DNA测序鉴定正确。
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图 1 ChREBP基因打靶路线图 Fig 1 Schematic demonstration for ChREBP targeting strategy A, B: Homologous arms for obtaining the ChREBP genomic DNA fragment; C, D: Homologous arms for insertion of the loxP-neo-loxP fragment; E, F: Homologous arms for insertion of the Frt-neo-Frt fragment. ChREBP: Carbohydrate response element-binding protein; NLS: Nuclear localization signal; Pro-rich: Proline-rich; b-HLH: Basic helix-loop-helix; ZIP: Zipper; Alb: Albumin; WT: Wild type; neo: Neomycin resistance cassette; TK: Thymidine kinase |
2.2 ES细胞的基因打靶与同源重组鉴定
打靶载体DNA经NotⅠ酶切线性化后，通过电穿孔转染ES细胞，经正负筛选获得抗性克隆88个。对其基因组DNA在打靶载体5′和3′同源臂与细胞基因组的同源重组情况进行PCR扩增鉴定，结果在5个候选克隆中检测到2个同源臂均发生同源重组，分别为B1、B2、D2、D6和E10（图 2）。对同源重组的PCR产物经酶切和DNA测序鉴定，表明上述ES细胞克隆为正确的同源重组克隆，用于后续显微注射和囊胚移植。
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图 2 同源重组阳性ES细胞克隆的PCR基因型鉴定 Fig 2 Identification of homologous recombinant positive ES clones by PCR genotyping ES cell: Embryonic stem cell; 5p: 5′Homologous recombination arm; 3p: 3′Homologous recombination arm; M: DNA ladder marker. B1, B2, D2, D6, E10: Clones with correct homologous recombination of both homologous arms |
2.3 首建鼠的获得与繁育
先后分别注射上述5株ES细胞克隆至268枚囊胚，并将胚胎移植至26只受体假孕雌鼠，得到8只F0代小鼠。从毛色判断，其中4只雄性小鼠嵌合度＞50%。将嵌合雄鼠与野生C57BL/6J雌鼠交配，其中分别来自ES细胞克隆B2、D2的2只嵌合鼠产生F1代灰鼠23只。经PCR鉴定，其中5只为阳性杂合子小鼠（图 3），从而获得可以种系传代的基因工程小鼠，记为ChREBPflox-neo/+ 小鼠。为去除neo基因，将该F1代杂合子小鼠与flp转基因小鼠交配，获得同时携带flp与ChREBPflox-neo的子代小鼠，通过鼠尾基因组DNA的PCR检测，证实neo基因被成功去除，将不含neo基因的ChREBP重组等位基因记为ChREBPflox/+（图 4A）。进一步与C57BL6/J小鼠交配，获得不含有flp的ChREBPflox/+小鼠。
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图 3 F1代小鼠ChREBP基因重组的PCR基因型鉴定 Fig 3 Identification of recombinant ChREBP gene in F1 mice by PCR genotyping ChREBP: Carbohydrate response element-binding protein; 5p: 5′Homologous recombination arm; 3p: 3′Homologous recombination arm; WT: Wild type; M: DNA ladder marker. 12, 13, 16, 17, 19：F1 mice with ChREBPflox-neo/+ genotype |
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图 4 小鼠基因型和ChREBP基因敲除PCR鉴定结果 Fig 4 PCR genotyping and ChREBP gene knockout results of mice A: Identification of neo gene deletion in mice by PCR genotyping; B: Identification of ChREBP gene deletion in mice by PCR genotyping; C: Identification of ChREBP gene deletion in the liver of mice by PCR; D: Identification of ChREBP gene deletion in the intestine of mice by PCR. ChREBP: Carbohydrate response element-binding protein; WT: Wild type; KO: Knockout |
2.4 条件敲除小鼠的建立
将ChREBPflox/+小鼠与Alb-Cre小鼠进行交配，获得ChREBPflox/+; Alb-Cre杂合小鼠；然后，通过杂合子与杂合子小鼠的交配获得ChREBPflox/flox; Alb-Cre纯合子小鼠，即为ChREBP的肝脏特异性敲除小鼠。为便于快速的批量基因型分析，本研究针对第8外显子下游的loxP位点设计了基因型鉴定引物，可分别从野生型和重组的ChREBP等位基因中扩增出593 bp、681 bp的DNA条带（图 4B），结合Cre的鉴定结果，可快速判断小鼠的基因型。另外，提取肝脏及小肠组织基因组DNA，针对第8外显子设计引物进行PCR，结果显示ChREBP基因在肝脏中被特异性敲除，而肠道中的ChREBP基因则不受影响（图 4C、4D）。
3 讨论自2001年ChREBP被发现以来，对ChREBP的生理功能的研究一直在持续向前推进。在以往对小鼠ChREBP全身敲除模型的研究中发现，全身ChREBP敲除小鼠对果糖不耐受，糖酵解及脂肪酸合成能力减弱[10]，肝脏糖原堆积[5]。近年研究发现，肝脏ChREBP在介导肝脏免受毒性损伤方面发挥重要作用[11]；脂肪中的ChREBP缺失会导致全身的胰岛素抵抗，并使葡萄糖转运受损[12]；肠道中ChREBP的缺失则会导致果糖吸收障碍和不耐受[13]，这些结果表明ChREBP在体内糖脂代谢中发挥着重要的生理功能。此外，ChREBP也对肿瘤的发生、发展有着重要的影响。例如, 在人结肠癌细胞系HTC116中抑制ChREBP可导致p53激活[14]；在前列腺癌中，ChREBP的激活与肿瘤细胞的增殖扩散有关[15]；而在白血病中，ChREBP则可促进白血病细胞的分化从而减少白血病的发生、发展。这些结果提示ChREBP在不同的细胞中对肿瘤的发生、发展有着不同的作用，ChREBP的体内功能具有复杂多样性。
为了更好地研究ChREBP在体内的生物学功能，本研究利用Cre/loxP系统建立了ChREBP的条件敲除小鼠模型。Cre/loxP系统源于F1噬菌体，通过Cre重组酶特异性识别loxP位点并切割位于2个loxP之间的DNA序列，达到敲除某个基因的目的[16]。这种方法不仅可以实现对某种组织特定基因的敲除，并且具有敲除效率高、应用范围广、胚胎致死率低的优点[17]，因而其在动物基因敲除方面应用广泛。ES细胞法是目前制备转基因动物的常用方法。ES细胞是从早期胚胎和原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外无限增殖、多向分化、自我更新的特点。将外源性基因通过电穿孔等方法导入ES细胞后，分选获得克隆正确、生长较好的ES细胞，将其注射入小鼠胚泡中可发育形成嵌合体小鼠，再经过杂交即可获得纯合子小鼠。在本研究中，我们采用ES细胞法构建ChREBP转基因小鼠。首先利用A、B 2个同源臂在体外将包含第8号外显子的长片段克隆至取获载体，构建了预打靶载体，然后分别利用C、D和E、F这4个小同源臂分别将loxP位点以及Frt-neo-Frt片段引入，构建成打靶载体pBR322-MK-ChREBP-KO，之后将构建好的打靶载体通过电穿孔法转入到ES细胞，通过正负性筛选获得正确的同源重组克隆并进行鉴定，挑选正确的克隆进行囊胚注射后移植入假孕雌鼠子宫中，获得嵌合鼠后继续进行交配繁殖，获得纯合子Flox小鼠后，将其与Alb-Cre小鼠交配，即实现了在小鼠肝脏组织敲除ChREBP。
本研究利用Cre/loxP系统成功建立了ChREBP条件性基因敲除小鼠模型，为揭示不同组织中ChREBP的生理功能和病理学意义提供了重要手段。
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