2019, Vol. 40
银屑病是一种自身免疫性皮肤病，全球发病率约为2%[1-2]。难治愈性和高复发率是银屑病临床治疗中最大的挑战，且长时间的治疗加重了个人和社会的经济负担[3]。近年来，阿维A、甲氨蝶呤联合光疗在银屑病患者治疗中取得了良好的疗效，然而仍有部分患者对于该联合治疗不应答[4-7]。因此，探索该联合治疗疗效的预测因素对于银屑病的个体化治疗及提高疗效起着重要作用。
微RNA-126（microRNA-126，miRNA-126）源自染色体9q34.3，可通过参与免疫和炎症反应影响银屑病等自身免疫性疾病的发生、发展[8-10]。然而对于接受阿维A、甲氨蝶呤联合光疗治疗的银屑病患者，其血浆miRNA-126在治疗过程中的变化情况及其对于疗效的预测作用尚未见报道。本研究旨在探索接受阿维A、甲氨蝶呤联合光疗治疗的银屑病患者血浆miRNA-126在治疗前后的表达水平及其对于疗效的预测作用。
1 资料和方法 1.1 研究对象连续纳入196例于2015年7月至2018年6月在武汉市第一医院接受阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗的中重度银屑病患者。纳入标准：（1）诊断为银屑病；（2）疾病严重程度为中重度，定义为受累体表面积（body surface area，BSA）≥10%，银屑病皮损面积及严重度指数（psoriasis area and severity index，PASI）≥8；（3）年龄≥18岁；（4）准备接受阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗；（5）经研究者评估可定期随访的患者。排除标准：（1）脓疱型或红皮病型银屑病；（2）伴随除银屑病以外的皮肤炎性疾病，或伴随其他系统性免疫疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等的患者；（3）有严重感染史、肿瘤史或恶性血液病史者；（4）妊娠及哺乳期妇女。纳入同期200名在武汉市第一医院进行健康体检且年龄和性别与入组银屑病患者相匹配的志愿者作为健康对照，所有健康对照者均无银屑病、皮肤炎性疾病、严重感染、系统性免疫疾病或恶性血液病史。本研究通过武汉市第一医院伦理委员会审批，所有纳入研究的银屑病患者和健康对照均签署知情同意书。
1.2 基线数据收集所有银屑病患者入组后，详细记录其年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、病程、治疗史和银屑病受累BSA，计算基线PASI[11]。同时采集健康对照的年龄、性别和BMI等信息。
1.3 治疗方法入组银屑病患者依据病情需要和个人意愿采用阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗，治疗方案为：阿维A酸，30 mg/d，口服；甲氨蝶呤，第1个月每周7.5 mg，然后根据病情调整用量（每周5.0~15.0 mg）持续至第6个月，口服；紫外线光疗，0.4 J/cm2，每周2次。
1.4 血浆样本采集分别于治疗开始前及治疗1个月、3个月、6个月后采集所有银屑病患者血液标本，健康对照在入组后采集血液标本。将血液标本在4 ℃下以625×g离心20 min，分离血浆，将血浆保存于-80 ℃冰箱待测。
1.5 血浆miRNA-126水平检测从血浆中提取总RNA，用分光光度计测定RNA的纯度和浓度。使用miRCURY LNA通用cDNA合成试剂盒（丹麦Exiqon公司）将RNA反转录为cDNA。通过实时定量PCR检测miRNA-126的表达。以U6作为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miRNA-126的相对表达量。引物序列：miRNA-126上游引物5'-ACA CTC CAG CTG GGC ATT ATT ACT TTT GGT AC-3'，下游引物5'-TGT CGT GGA GTC GGC AAT TC-3'；U6上游引物5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'，下游引物5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'。
1.6 应答评估分别于治疗前及治疗1个月后、3个月后和6个月后评估PASI，并计算相应的PASI 50和PASI 75应答率。PASI 50应答定义为治疗后PASI与基线期相比下降50%，PASI 75应答定义为治疗后PASI与基线期相比下降75%。随访过程中共有22例患者脱落，脱落原因主要为发生不良反应（6例）及失访（16例）。对于脱落的患者，以退出或失访前最后1次检测的miRNA-126相对表达量作为后续缺失的miRNA-126检测值，以退出或失访前最后1次评估的PASI作为后续缺失的PASI。最终，所有196例银屑病患者均纳入分析。
1.7 统计学处理使用SPSS 22.0软件（美国IBM公司）和GraphPad Prism 6.01软件（美国GraphPad公司）进行统计学分析和图表制作。计量资料以x±s或中位数（下四分位数，上四分位数）表示，两组间比较采用独立样本t检验或Wilcoxon秩和检验，组内前后配对资料的比较采用Wilcoxon符号秩和检验；计数资料以例数和百分数表示，两组间比较采用Pearson χ2检验。连续变量之间的相关性分析采用Spearman等级相关检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估miRNA-126相对表达量对银屑病的诊断价值；采用单因素和多因素logistic回归模型分析PASI 50应答和PASI 75应答的影响因素，其中多因素logistic回归模型分析采用向前选择法（条件）。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 一般资料纳入研究的196例银屑病患者平均年龄为（41.3±10.0）岁，男108例、女88例，平均BMI为（23.5±2.6）kg/m2，中位病程为10.0（6.0，16.0）年，中位受累BSA为25.0%（18.0%，29.0%），中位PASI为11.8（10.3，16.6）。此外，分别有174例（88.8%）、148例（75.5%）、135例（68.9%）和34例（17.3%）患者有局部治疗、光疗、系统性非生物制剂治疗和系统性生物制剂治疗史。健康对照平均年龄为（40.9±8.2）岁，男121例、女79例，平均BMI为（23.9±3.1）kg/m2。两组研究对象年龄、性别、BMI差异均无统计学意义（P均>0.05）。
2.2 银屑病患者基线期血浆miRNA-126表达水平及其与临床特征的关联银屑病患者基线期血浆miRNA-126相对表达量低于健康对照[0.756（0.306，1.185）vs 1.520（0.556，2.834）]，差异有统计学意义(P < 0.001）。ROC曲线分析显示血浆miRNA-126表达水平区分银屑病患者与健康对照的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.700 [95%置信区间（confidence interval，CI）：0.648~0.752]，最佳截断值为1.365，此时灵敏度为80.1%，特异度为56.5%（图 1）。
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图 1 ROC曲线分析miRNA-126相对表达量诊断银屑病的价值 Fig 1 ROC curve of plasma miRNA-126 relative level for diagnosis of psoriasis ROC: Receiver operating characteristic; miRNA: microRNA; AUC: Area under curve |
Spearman等级相关检验表明基线期血浆miRNA-126相对表达量与银屑病患者PASI呈负相关（r=-0.222，P=0.002），而与患者年龄、BMI、病程、受累BSA均无明显关联（r=0.116、0.094、0.060、-0.018，P均>0.05）。Wilcoxon秩和检验结果表明，银屑病患者基线期血浆miRNA-126相对表达量与患者性别[女性患者0.703（0.255，1.066），男性患者0.806（0.386，1.309）]、局部治疗史[无局部治疗史患者0.604（0.313，1.766），有局部治疗史患者0.769（0.303，1.175）]、光疗史[无光疗史患者0.661（0.322，1.003），有光疗史患者0.792（0.300，1.211）]、系统性非生物制剂治疗史[无系统性非生物制剂治疗史患者0.582（0.243，1.234），有系统性非生物制剂治疗史患者0.769（0.354，1.170）]、系统性生物制剂治疗史[无系统性生物制剂治疗史患者0.769（0.352，1.222），有系统性生物制剂治疗史患者0.750（0.230，1.013）]均无明显关联（P均>0.05）。
2.3 治疗过程中PASI 50和PASI 75应答率银屑病患者经阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗1个月、3个月和6个月后，PASI 50应答率分别为7.1%（14/196）、37.2%（73/196）及64.8%（127/196），PASI 75应答率分别为1.5%（3/196）、14.3%（28/196）及35.7%（70/196）。
2.4 血浆miRNA-126相对表达量在治疗期间的变化由表 1可见，银屑病患者血浆miRNA-126相对表达量在治疗1个月、3个月和6个月后相比于基线期均增高，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。以第6个月时PASI 50应答与否将患者分为PASI 50应答组（127例）及PASI 50未应答组（69例），PASI 50应答患者的基线期血浆miRNA-126相对表达量低于PASI 50未应答患者（P < 0.01）；两组患者血浆miRNA-126相对表达量在治疗1个月、3个月和6个月后相对于基线期均增高（P < 0.01，P < 0.05），但PASI 50未应答患者增高幅度较PASI 50应答患者小。以第6个月时PASI 75应答与否将患者分为PASI 75应答组（70例）及PASI 75未应答组（126例），PASI 75应答患者的基线期血浆miRNA-126相对表达量也低于PASI 75未应答患者（P < 0.01）；两组患者血浆miRNA-126相对表达量在治疗1个月、3个月和6个月后相对于基线期均增高（P均＜0.01）。
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表 1 银屑病患者血浆miRNA-126相对表达量在治疗期间的变化 Tab 1 Changes of relative expression of plasma miRNA-126 in psoriasis patients during treatment period |
2.5 影响PASI 50和PASI 75应答的因素
单因素logistic回归分析结果显示，基线期血浆miRNA-126相对表达量[比值比（odds ratio，OR）=0.156，P < 0.001]及系统性非生物制剂治疗史（OR=0.253，P < 0.001）与银屑病患者PASI 50应答呈负相关，基线期血浆miRNA-126相对表达量（OR=0.511，P=0.006）、系统性非生物制剂治疗史（OR=0.532，P=0.047）及系统性生物制剂治疗史（OR=0.407，P=0.048）与PASI 75应答呈负相关（表 2）。多因素logistic回归分析（向前）结果显示基线期血浆miRNA-126相对表达量（OR=0.151，P < 0.001）、系统性非生物制剂治疗史（OR=0.334，P=0.015）及系统性生物制剂治疗史（OR=0.391，P=0.043）均与银屑病患者PASI 50应答独立负相关，基线期血浆miRNA-126相对表达量（OR=0.489，P=0.004）及系统性生物制剂治疗史（OR=0.366，P=0.030）均与银屑病患者PASI 75应答独立负相关（表 2）。
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表 2 银屑病患者PASI 50和PASI 75应答影响因素的logistic回归分析结果 Tab 2 Logistic regression analysis of influencing factors on PASI 50 and PASI 75 responses in psoriasis patients |
3 讨论
近年研究发现，miRNA-126参与许多自身免疫性疾病的发生和进展[12-15]。然而目前其在银屑病中的作用尚未见报道。本研究检测了银屑病患者与健康对照血浆miRNA-126的表达水平，发现miRNA-126在银屑病患者血浆中低表达，且对于银屑病具有良好的诊断价值。有证据表明miRNA-126在炎症相关性疾病中表达降低，上调miRNA-126的表达可抑制炎症反应[16-17]。另外，miRNA-126在血浆中的表达水平可能受到炎症的反向调控，高水平的γ干扰素和肿瘤坏死因子α可降低血浆miRNA-126的表达[9]。因此，miRNA-126在银屑病患者血浆中低表达可能与炎症反应有关。本研究还发现基线期血浆miRNA-126表达水平与银屑病患者PASI呈负相关。可能的原因是miRNA-126通过抑制炎症相关基因从而降低患者的炎症反应，继而减轻皮损严重程度，故血浆miRNA-126基线水平与银屑病患者PASI呈负相关。
阿维A和甲氨蝶呤是中重度银屑病的一线用药，两者联合光疗治疗是中国最普遍的银屑病系统性治疗方法之一[3]。本研究观察到银屑病患者经阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗1个月、3个月和6个月后，PASI 50应答率分别为7.1%（14/196）、37.2%（73/196）及64.8%（127/196），PASI 75应答率分别为1.5%（3/196）、14.3%（28/196）及35.7%（70/196），说明阿维A、甲氨蝶呤联合光疗治疗大幅度降低了银屑病患者PASI与疾病严重程度。本研究还发现，随着治疗时间的延长，银屑病患者血浆miRNA-126相对表达量逐渐升高，且PASI 50应答患者血浆miRNA-126相对表达量增幅更加明显。这可能是由于相对于PASI 50未应答患者，PASI 50应答患者中PASI的降低更为显著，患者疾病严重程度和炎症反应缓解幅度更明显，而miRNA-126与炎症反应有关，故血浆miRNA-126相对表达量的增加幅度也更大。
已有研究证实miRNA-126对于某些肿瘤的治疗效果具有预测作用[18-21]，然而在自身免疫性疾病中miRNA-126能否预测治疗效果仍缺乏研究。本研究探索了miRNA-126对阿维A、甲氨蝶呤联合光疗治疗银屑病疗效的预测作用，发现PASI 50和PASI 75应答患者miRNA-126基线水平低于PASI 50和PASI 75未应答患者，且logistic回归分析结果显示银屑病患者基线期血浆miRNA-126相对表达量与PASI 50和PASI 75应答呈独立负相关。可能的原因是：血浆miRNA-126表达水平越低，患者疾病更严重，意味着治疗后患者疾病缓解空间更大，进而PASI降低幅度更大。因此，血浆miRNA-126基线期相对表达量与银屑病患者PASI 50和PASI 75应答负相关。此外，miRNA-126是否会影响细胞对药物的敏感性或使细胞产生抗药性，从而降低治疗效应，进而导致银屑病患者更差的PASI 50和PASI 75应答尚不明确，仍需进一步研究。
综上所述，本研究发现银屑病患者血浆miRNA-126表达水平在接受阿维A、甲氨蝶呤联合紫外线光疗治疗后逐渐升高，且其基线期表达水平与治疗效果独立负相关。但本研究仍存在一些缺陷：（1）本研究中所有研究对象均来自同一所医院，这可能会导致地区选择上的偏倚并影响研究对象的代表性。（2）本研究纳入的样本量相对较小，可能会导致研究结果的统计学意义被削弱，故有必要扩大样本量进一步研究。
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