超声引导下经皮微波消融术是治疗甲状腺结节的新兴方法，近年来凭借出血少、微创伤、无瘢痕、保护甲状腺功能等优势在临床上逐渐受到重视^[1-2]。超声引导下经皮热消融治疗的本质在于通过射频、微波、激光等手段使病灶受热发生凝固性坏死，坏死组织经患者自身免疫系统逐渐吞噬吸收、直至消失。研究证实，虽然甲状腺结节热消融术后即刻消融区组织结构仍维持原态，但受热细胞已失去活性^[3-4]。由于患者病灶的大小、位置、周围血供及患者的自身免疫状态等存在个体差异，消融区坏死组织吸收的速度不一，消失的时间也从数月至数年不等^[5]，在此期间，消融区组织结构是否瓦解、是否存在活性备受关注。微波消融术后6个月是消融区病理变化的关键点，此时消融区内多呈大片坏死组织，偶可见少量细胞，但此期细胞活性状态如何尚未见文献报道。本研究通过观察微波消融术后6个月甲状腺结节消融区的细胞活性关键酶琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase，NADPH-d）的活性，探讨消融区是否会出现凝固变性细胞未完全坏死甚至复活的情况。

选择自2017年12月至2018年9月于海军军医大学（第二军医大学）长征医院及上海国际医学中心复诊的甲状腺结节微波消融治疗术后6个月的患者20例，其中女性15例、男性5例，年龄为18~65岁，中位年龄为45岁。20例复诊患者中单发甲状腺结节者16例16枚结节，多发结节者4例共8枚结节。纳入标准：（1）经微波消融治疗甲状腺结节术后6个月对消融区进行病理学评估的患者；（2）甲状腺结节微波消融区各径线长度均＞10 mm，满足粗针穿刺活组织检查的要求且取材区域均位于消融区内；（3）消融区位置有安全穿刺路径。排除标准：（1）有严重出血倾向或凝血障碍的患者；（2）服用抗凝药物且停药不足2周的患者；（3）穿刺路径有无法避开的粗大血管或其他重要结构的患者。本研究经海军军医大学（第二军医大学）长征医院伦理委员会及上海国际医学中心伦理委员会审批，所有患者均签署知情同意书。

使用意大利百胜MyLab^TM Alpha便携式彩色超声诊断系统（高频探头频率为7×10⁶~14×10⁶ Hz）行超声引导下穿刺。使用意大利Presia HS半自动切割式活检针（针长100 mm、外径18 G、切割槽10 mm/20 mm可调）行组织学标本取材。琥珀酸脱氢钠购自美国Sigma公司，氯化硝基四氮唑蓝（nitro blue tetrazolium chloride，NBT）、Triton X-100及β-NADPH均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

患者取仰卧位、颈部略后伸，常规消毒铺洞巾，局部浸润麻醉皮肤穿刺点及穿刺路径，于超声实时引导下对消融区进行粗针穿刺活组织检查，根据消融区取材部位径线调整活检针切割槽长度。取材部位：（1）消融区中央域，即消融区中央部位；（2）消融区边缘域，即消融区内距离边缘5 mm以内的部位。边缘域取材部位不满足活检针切割槽范围时，则仅对中央域取材。所得组织条置入冻存管放入液氮罐冷冻，制作冰冻切片，切片厚度为7~10 μm，然后分别使用琥珀酸脱氢钠和NBT行酶组织化学染色检测SDH及NADPH-d活性，并行常规H-E染色后观察组织结构和细胞形态。

镜下观察SDH及NADPH-d酶组织化学染色阳性均为紫黑色，表示SDH及NADPH-d有活性。任选5个高倍镜（×400）视野观察，根据紫黑色颗粒的数量和范围将每张切片的染色强度分为3个等级：（1）阴性，无紫黑色颗粒；（2）弱阳性，散在少量紫黑色颗粒；（3）阳性，5个高倍镜视野中有3个或3个以上视野为大量或满视野紫黑色颗粒。镜下观察H-E染色石蜡切片中消融区组织结构和细胞形态情况，判断凝固性坏死程度。

采用SPSS 20.0软件进行数据处理。计数资料以例数和百分数表示。比较各区域SDH与NADPH-d酶组织化学染色情况，判断二者染色结果是否一致并与H-E染色结果对照分析。两种染色结果一致性分析采用Kappa检验，Kappa值≥0.75表示一致性较好，Kappa值＜0.4表示一致性较差，Kappa值为0.4~0.74表示一致性一般。采用Fisher确切概率法比较同一区域SDH与NADPH-d阴性率。检验水准（α）为0.05。

本组20例患者共24个消融区。对所有消融区中央域及边缘域均成功穿刺取材，共获得48个组织条，标本条长度为10~20 mm，直径约1 mm，颜色苍白或淡红，连续性好。

镜下观察23个（95.83%）消融区中央域SDH及NADPH-d染色呈阴性，镜下均未见紫黑色颗粒（图 1A、1B）；1个消融区中央域SDH及NADPH-d染色呈阳性，镜下见紫黑色颗粒（图 2A、2B）；消融区中央域SDH与NADPH-d酶组织化学染色阴性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。镜下观察22个（91.67%）消融区边缘域SDH及NADPH-d染色呈阴性，镜下均未见紫黑色颗粒（图 3A、3B）；2个消融区边缘域SDH及NADPH-d染色呈阳性，镜下均见紫黑色颗粒（图 4A、4B）；消融区边缘域SDH与NADPH-d酶组织化学染色阴性率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。48条标本制成酶组织染色切片，镜下观察SDH染色与NADPH-d染色结果均一致，消融区两种染色在中央域及边缘域一致性均较好，Kappa值均为1。

图 1 甲状腺结节微波消融术后6个月消融区中央域SDH（A）、NADPH-d（B）酶组织化学染色阴性结果 Fig 1 Negative enzyme histochemical staining of SDH (A)and NADPH-d (B) in central ablation region of thyroid nodules at 6 months after microwave ablation SDH: Succinate dehydrogenase; NADPH-d: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase. Original magnification: ×200

图 2 甲状腺结节微波消融术后6个月消融区中央域SDH、NADPH-d酶组织化学染色阳性结果 Fig 2 Positive enzyme histochemical staining of SDH and NADPH-d in central ablation region of thyroid nodules at 6 months after microwave ablation A: Enzyme histochemical staining of SDH showed that purple-black particles were visible in some areas of the central ablation region, suggesting that SDH was active; B: Enzyme histochemical staining of NADPH-d showed that purple-black particles were visible in some areas of the central ablation region, suggesting that NADPH-d was active. SDH: Succinate dehydrogenase; NADPH-d: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase. Original magnification: ×100

图 3 甲状腺结节微波消融术后6个月消融区边缘域SDH（A）、NADPH-d（B）酶组织化学染色阴性结果 Fig 3 Negative enzyme histochemical staining of SDH (A) and NADPH-d (B) in the marginal ablation region of thyroid nodules at 6 months after microwave ablation SDH: Succinate dehydrogenase; NADPH-d: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase. Original magnification: ×200

图 4 甲状腺结节微波消融术后6个月消融区边缘域SDH、NADPH-d酶组织化学染色阳性结果 Fig 4 Positive enzyme histochemical staining of SDH and NADPH-d in the marginal ablation region of thyroid nodules at 6 months after microwave ablation A: Enzyme histochemical staining of SDH showed that purple-black particles were visible in some areas of the marginal ablation region, suggesting that SDH was active; B: Enzyme histochemical staining of NADPH-d showed that pale purple-black particles were visible in some areas of the marginal ablation region, suggesting that NADPH-d was active. SDH: Succinate dehydrogenase; NADPH-d: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase. Original magnification: ×100

H-E染色镜下观察结果显示23个消融区中央域及22个消融区边缘域均呈现大片凝固性坏死组织，红染无结构（图 5A、5B），其对应的SDH及NADPH-d活性均为阴性。1个消融区中央域及2个消融区边缘域H-E染色镜下显示部分为片状坏死结构，部分为纤维组织增生，片状坏死处相应部位的SDH及NADPH-d染色均呈阴性，纤维组织增生处（图 5C、5D）对应SDH及NADHP-d为阳性。

图 5 甲状腺结节微波消融术后6个月消融区中央域和边缘域H-E染色 Fig 5 H-E staining in central and marginal ablation regions of thyroid nodules at 6 months after microwave ablation A: H-E staining in the central ablation region showed pink amorphous mass of necrotic material; B: H-E staining in the marginal ablation region showed pink amorphous mass of necrotic material; C: H-E staining showed necrotic material and proliferation of fibrous tissue in the central ablation region, and enzyme histochemical staining of SDH and NADPH-d was both positive in hyperplastic fibrous tissue; D: H-E staining showed necrotic material and proliferation of fibrous tissues in the marginal ablation region, and enzyme histochemical staining of SDH and NADPH-d was both positive in hyperplastic fibrous tissues. SDH: Succinate dehydrogenase; NADPH-d: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate diaphorase. Original magnification: ×200 (A, B); ×100 (C, D)

细胞内SDH和NADPH-d是细胞呼吸的关键酶，研究人员通常使用酶组织化学染色法检测SDH和NADPH-d的活性并以此判断组织细胞的活性^[6-12]。本团队既往研究发现，SDH及NADPH-d广泛存在于甲状腺组织及甲状腺结节细胞中，并具有活性；当甲状腺结节接受微波热消融治疗时，这2种酶瞬间受热失去活性，酶组织化学染色呈阴性，提示经微波消融治疗后甲状腺结节内细胞迅速进入失活状态^[13]。本研究也采用酶组织化学染色法证实SDH与NADPH-d的活性状态具有高度一致性。因此，SDH、NADPH-d酶组织化学染色能够同时真实反映组织中细胞的活性状态。

研究证实微波消融治疗使组织受热凝固，术后即刻在光学显微镜下观察到受热组织的结构、细胞外形和排列、细胞核形态暂不会发生明显变化，此时组织处于彻底坏死前的热凝固状态，之后随着时间推移消融区组织才会逐渐溶解、吸收、消失^[1]。虽然人体消融区组织随时间推移其病理演变过程不易获得，但可推测这一过程应与病理学上凝固性坏死的转归一致^[14]。文献报道，个别患者热消融术后1周、1个月进行手术切除，消融区病理切片除可见坏死区外，亦可见结构形态完整的肿瘤细胞^[15-16]，说明这时消融区组织仍未进入完全坏死阶段。本研究发现，甲状腺结节微波消融术后6个月时消融区几乎均呈现大片红染坏死无结构样，提示此时消融区坏死组织结构已经完全崩塌溶解，在此时检测酶活性能更全面地了解陈旧消融区组织的活性状态。

本研究发现微波消融术后6个月多数消融区中央域SDH及NADPH-d酶组织化学染色法检测结果均一致，呈阴性，结合H-E染色镜下病理观察到的大片红染无结构，提示此区域已进入完全坏死状态，在形态和功能两个方面都不再是病灶，无需担心消融区的存在会对患者造成不良影响。1个消融区中央域、2个消融区边缘域酶活性染色部分区域为阳性，其对应H-E染色区域恰为纤维组织增生的区域。在失活的坏死消融区中央或边缘出现具有活性的纤维组织细胞，正符合组织损伤修复过程中的改变。

本研究对甲状腺结节微波消融术后6个月消融区细胞活性状态进行了初步探讨，SDH、NADPH-d酶组织化学染色与H-E染色组织学方法结合可较为客观全面地评估消融区组织的活性状态。本研究也存在一些不足：（1）仅对消融术后6个月甲状腺消融区进行评估，对术后1、3、12个月时的消融区细胞活性情况还需进一步研究；（2）纳入的病例数较少，尚待更多数据进一步验证本研究结论。