第二军医大学学报  2019, Vol. 40 Issue (1): 54-60   PDF    
引用本文
谢震宇, 费怡, 杨天, 殷建华, 蒲蕊. 乙型肝炎表面抗原阳性学生及其一级亲属乙型肝炎病毒感染流行病学调查与病毒变异分析[J]. 第二军医大学学报, 2019, 40(1): 54-60  
XIE Zhen-yu, FEI Yi, YANG Tian, YIN Jian-hua, PU Rui. Epidemiological investigation of hepatitis B virus infection and analysis of virus mutations in hepatitis B surface antigen positive students and their frst-degree relatives[J]. Academic Journal of Second Military Medical University, 2019, 40(1): 54-60 (in Chinese with English abstract)  
乙型肝炎表面抗原阳性学生及其一级亲属乙型肝炎病毒感染流行病学调查与病毒变异分析
谢震宇1, 费怡2, 杨天2, 殷建华3, 蒲蕊3     
1. 上海市浦东新区妇幼保健院预防保健科, 上海 201206;
2. 上海市浦东新区疾病预防控制中心免疫预防科, 上海 200136;
3. 海军军医大学(第二军医大学)热带医学与公共卫生学系流行病学教研室, 上海 200433
收稿日期: 2018-04-01    接受日期: 2018-06-12
基金项目: 上海市卫生和计划生育委员会科研课题（201540057），上海市第四轮公共卫生三年行动计划高端海外研修团队项目（GWTD2015S05）.
作者简介: 谢震宇, 硕士, 副主任医师
通信作者(Corresponding author): 谢震宇, Tel:021-50301752, E-mail:xiezhenyu@sina.com
摘要: 目的 探讨乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性学生家庭内乙型肝炎病毒（HBV）感染状况以及肝细胞癌相关的HBV变异情况，为HBV感染、肝细胞癌的防控提供科学依据。方法 从浦东新区15个学校及幼儿园60个班级中调查学生1 611名，其中HBsAg阳性学生8名。对该8名学生及其18名一级亲属进行流行病学调查，采集静脉血应用酶联免疫吸附实验检测乙肝五项。采用荧光PCR法检测HBV DNA，采用multiplex-PCR、巢式PCR法联合克隆测序方法检测HBV基因组、基本核心启动子（BCP）区和前S（PreS）区。结果 一级亲属HBsAg与HBcAb阳性率分别为33.3%（6/18）与38.9%（7/18）。母亲HBsAg与HBcAb阳性率均为71.4%（5/7），高于其他一级亲属阳性率（P < 0.05）。8个家庭中7个家庭（87.5%）有2人及2人以上HBV感染或曾经感染，8个家庭共26名家庭成员中14人HBsAg阳性，阳性率为53.8%。共检测了4组母亲和子女的HBV基因，其中3组HBV基因为C型，1组母亲为C型、子女为B型；在肝细胞癌相关HBV变异中，子女的BCP区热点突变频率低于母亲，PreS区C型有8个变异位点在母亲和子女体内均表达、其余关键位点均未在子女体内发现。结论 HBV感染存在明显的家庭聚集性；此次调查结果显示学生HBV感染通过母婴传播可能性较大，但也存在后天血液传播等方式感染；子女HBV基因进化程度低于母亲，符合HBV进化的规律。
关键词: 乙型肝炎病毒     肝细胞癌     家庭聚集性     变异(遗传学)     母婴传播    
Epidemiological investigation of hepatitis B virus infection and analysis of virus mutations in hepatitis B surface antigen positive students and their frst-degree relatives
XIE Zhen-yu1, FEI Yi2, YANG Tian2, YIN Jian-hua3, PU Rui3     
1. Department of Prevention and Health Care, Maternity and Child Health Care Hospital of Shanghai Pudong New Area, Shanghai 201206, China;
2. Department of Preventive Immunization, Center of Disease Control and Prevention of Shanghai Pudong New Area, Shanghai 200136, China;
3. Department of Epidemiology, Faculty of Tropical Medicine and Public Health, Naval Medical University(Second Military Medical University), Shanghai 200433, China
Supported by Scientific Research Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (201540057) and Advanced Oversea Research and Training Program of the Fourth Round of "Three-Year Plan" for Public Health of Shanghai (GWTD2015S05).
Abstract: Objective To explore the infection status of hepatitis B virus (HBV) in families of hepatitis B surface antigen (HbsAg) positive students and the mutations of HBV related to hepatocellular carcinoma, so as to provide theoretic evidence for the prevention and control of HBV infection and hepatocellular carcinoma. Methods A total of 1 611 students were investigated; they were from 60 classes of 15 schools and kindergartens in Pudong New Area, Shanghai, China, and 8 HBsAg positive students were found. These 8 students and their 18 first-degree relatives were enrolled in this study. Venous blood samples were collected to test the 5 markers of hepatitis B using enzyme linked immunosorbent assay. HBV DNA was detected by fluorescent PCR. HBV genome, basic core promoter (BCP) region and PreS region were detected using multiplex-PCR and nested PCR combined with cloning and sequencing. Results The positive rates of HBsAg and HBcAb in the firstdegree relatives were 33.3% (6/18) and 38.9% (7/18), respectively. Both HBsAg and HBcAb positive rates in the mothers were 71.4% (5/7), which were significantly higher than those of the other first-degree relatives (P < 0.05). Seven of 8 families (87.5%) had 2 or more members infected or had ever infected with HBV. Fourteen of 26 members in 8 families had positive HBsAg, with a positive rate of 53.8%. A total of 4 groups of mothers and children received gene detection. Three groups of them had type C HBV gene, and 1 group had type C in mother and type B in child. Among the hepatocellular carcinomarelated HBV mutations, the mutation frequency of hot spots in BCP region was lower in the children than that in the mothers. Eight HBV mutation sites of type C in PreS region were found in both the mothers and children, and none of the remaining key sites were found in the children. Conclusion There is obvious family clustering of HBV infection, suggesting that HBV infection of students is more likely to be transmitted through mother-to-child transmission, but there are other ways of infection, such as acquired blood. The evolution degree of HBV gene in children is lower than that in mothers, which conforms to the rule of HBV evolution.
Key words: hepatitis B virus     hepatocellular carcinoma     family clustering     variation genetics     mother-to-child transmission    

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是中国主要公共卫生问题之一。中国大陆地区约有0.94亿HBV感染者，占全世界HBV感染者的1/3左右[1]。HBV传播具有家庭聚集性，长期的日常生活接触和母婴传播是HBV家庭内传播的主要途径。而慢性HBV感染者中30%的男性和10%的女性最终发展成肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。HBV变异与疫苗免疫逃逸、HBV隐匿性感染等密切相关，继而可导致肝硬化和HCC的发生。我们前期研究发现，HBV基因组前S（PreS）区、核心启动子/增强子/前C区变异与肝硬化和HCC显著相关[2-5]。本研究在浦东新区外来务工人员子女HBV感染及乙型肝炎疫苗免疫状况研究[6]基础上，初步探讨了HBsAg阳性学生及其一级亲属HBV感染与HBV变异状况，为制定相应的预防控制措施提供科学依据。

1 资料和方法 1.1 调查对象

2016年项目组在浦东新区开展外来务工人员子女HBV感染及乙型肝炎疫苗免疫状况研究[6]，从浦东新区5个城郊结合社区的15个学校及幼儿园60个班级中调查学生1 611名，经检测，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）阳性学生8名。对该8名学生及其18名一级亲属（血缘父亲、血缘母亲、同父母兄弟姐妹）进行流行病学调查，所有调查对象均知情同意。另有1名母亲、2名父亲、1名兄弟姐妹因故未能完成调查。

1.2 调查内容

由项目组人员对学生及其一级亲属进行问卷调查，调查内容包括调查对象基本情况、健康状况、家庭内HBV感染情况、乙型肝炎疫苗接种情况等。由统一培训的护士采集每位调查对象静脉血并送项目实验室检测乙肝五项，HBsAg阳性者检测HBV DNA含量、HBV基因型及HCC相关HBV基因变异等。

1.3 实验室检测 1.3.1 主要仪器与试剂

普通PCR仪（Master，德国Eppendorf公司）、梯度PCR仪（Veriti，美国ABI公司）、实时定量PCR仪（Roche LightCycler480，瑞士罗氏公司）、凝胶成像系统（Molecular Imager® Gel DocTM XR system 170-8170，美国Bio-Rad公司）、全波长多功能酶标仪（Synergy 2，美国Biotek公司）等。乙肝五项酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自上海科华生物工程股份有限公司，血液基因组DNA提取试剂盒（非离心柱型）购自天根生化科技（北京）有限公司，AxyPrep PCR清洁试剂盒购自AXYGEN中国公司，HBV核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自上海复星医药股份有限公司。所有商品检测试剂均在有效期内使用，检测结果按照试剂说明书进行判断。rTaq酶、10×上样缓冲液、pMD18-T载体系统购自宝生物工程（大连）有限公司。普通PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR产物测序由上海迈浦生物科技有限公司完成。

1.3.2 乙肝五项与DNA定量检测

采用ELISA定性检测HBsAg、乙型肝炎表面抗体（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗体（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗体（hepatitis B core antibody，HBcAb）五项指标。采用荧光PCR法检测血清中HBV DNA含量。

1.3.3 HBV基因型检测

采用我们前期建立的multiplex-PCR方法[7]检测HBV基因型。

1.3.4 HBV基因序列检测与分析

采用巢式PCR法联合扩增产物克隆测序的方法对HBV基因组基本核心启动子（basal core promoter，BCP）区和PreS区进行检测[8]。运用MEGA 5.0软件包对DNA序列进行比对和遗传进化分析。用Cluster W程序进行比对，用Phylogeny程序构建基因进化树，用Distance程序计算序列间的核苷酸和氨基酸距离。

1.4 统计学处理

采用EPI DATA 3.2软件建库，资料录入前经过严格核对，并于录入后进行资料核查。运用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计数资料各样本组间分布的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。统计学检验均为双侧检验，检验水准（α）为0.05。

2 结果 2.1 调查对象的基本情况

8名HBsAg阳性学生中男3名、女5名；平均年龄为（14.5±1.8）岁；仅4名接种过乙型肝炎疫苗，1名全程接种疫苗。8名学生的18名一级亲属中，学生母亲7名（38.9%）、父亲6名（33.3%）、兄弟姐妹5名（27.8%）；男、女各9名；父母亲的平均年龄为（42.4±6.9）岁，兄弟姐妹的平均年龄为（13.4±5.7）岁；13名（72.2%）为务工、务农或无业，4名（22.2%）为学生，1名（5.6%）为私营业主；文化程度均为高中以下；16名（88.9%）与HBsAg阳性学生共同居住；仅2名（11.1%）接种过乙型肝炎疫苗。13名父母亲中3名（23.1%，3/13）的父母亲或兄弟姐妹中有HBV感染。

2.2 HBV感染情况

8名HBsAg阳性学生中，大三阳（HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性）6名，小三阳（HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性）2名，5名HBV DNA≥105 copy/mL。

18名一级亲属中，HBsAg阳性6名（阳性率为33.3%），均为学生父母亲（父亲1名、母亲5名），均未接种过乙型肝炎疫苗，有2名（33.3%）的父母亲或兄弟姐妹中有HBV感染；6名HBsAg阳性父母亲来自于6个不同的家庭，6名中大三阳3名，小三阳2名；5名HBV DNA≥105 copy/mL，1名HBV DNA＜103 copy/mL。7名母亲中有5名HBsAg阳性，阳性率为71.4%，高于其他一级亲属阳性率（Fisher确切概率法，P＜0.05），见表 1、2。

表 1 8个家庭26名家庭成员乙肝五项、HBV DNA、HBV基因型及乙型肝炎疫苗接种情况 Tab 1 Five markers of hepatitis B, HBV DNA, HBV genotype and HBV vaccination of 26 members from 8 families

表 2 8名HBsAg阳性学生18名一级亲属HBV感染情况 Tab 2 HBV infection in 18 first-degree relatives of 8 HBsAg-positive students

18名一级亲属中，HBcAb阳性7名（阳性率为38.9%），其中学生父母亲6名（父亲1名、母亲5名）、学生弟弟1名，均未接种过乙型肝炎疫苗，有4名（57.1%）的父母亲或兄弟姐妹中有HBV感染；7名HBcAb阳性一级亲属来自于6个不同的家庭。7名母亲中，5名HBcAb阳性，阳性率为71.4%，高于其他一级亲属阳性率（Fisher确切概率法，P＜0.05），见表 1、2。

18名一级亲属中，HBsAg或HBcAb阳性共8名，来自于7个家庭。8个家庭中7个家庭（87.5%，7/8）有2名及以上HBV感染或曾经感染，见表 1。8个家庭共26名家庭成员中有14名HBsAg阳性，阳性率高达53.8%（14/26），见表 1。

2.3 HBV基因检测情况

此次研究共检测了6个家庭HBV基因，包括4个家庭的母亲和子女，1个家庭的1名父亲和1个家庭的1名子女。因为单个父亲和单个子女无匹配亲属，故分析时予以剔除，重点分析4个母亲与子女均完成检测的家庭（家庭序号为1-075、3-173、3-205、5-204）。

2.3.1 HBV基因型情况

采用进化树分析，发现4组母亲和子女样本中，有3组在进化树溯源分析中是属于同一亚型C型，但家庭序号5-204这一组的母亲为C型、子女为B型。

2.3.2 与HCC相关HBV基因变异情况

HCC相关HBV BCP区变异：在不区分基因型的基础上，如T1674C/G、G1719T、A1727G/T、C1730G、C1799G、G1986A等热点突变频率子女低于母亲，子女在HBV进化程度上低于母亲。同时，也未发现母亲和子女中出现HCC指向性很高的双突变，见表 3。在子女不同基因亚型中，C型中T1674C/G、G1719T突变率高于B型，但差异不具有统计学意义；A1727G/T突变B型中较高（P＜0.05）；A1652G、C1673T、C1730G、C1799G在C型中未发现变异，见表 4。

表 3 4组母亲与子女HCC相关HBV BCP区变异情况 Tab 3 HCC-related HBV mutations in BCP region in 4 groups of mothers and children

表 4 HCC相关HBV BCP区变异在子女不同基因型中分布情况 Tab 4 Distribution of HCC-related HBV mutations in BCP region of different genotypes in children

HCC相关HBV PreS区变异：在子女不同亚型中，C型中共有8个变异（C3026T、C3051T、C3116T、A3186G、A7C、T31C、T52C、A109T）在母亲和子女体内均有表达，其余关键位点均未在子女体内发现。B型热点变异突变频率高于C型，见表 5。

表 5 HCC相关HBV PreS区变异在子女不同基因型中分布情况 Tab 5 Distribution of HCC-related HBV mutations in PreS region in different genotypes of children

3 讨论

家庭聚集性受较多因素的影响，包括遗传因素、环境因素、生活行为因素等，其中母婴垂直传播和日常生活密切接触是HBV感染呈现家庭聚集性的主要原因[9-10]。2010年一项调查表明，上海市HBV感染亦呈家庭聚集性[11]。因此，本研究招募了HBsAg阳性学生的一级亲属进行调查与检测，结果发现一级亲属HBsAg阳性率为33.3%（6/18），HBcAb阳性率为38.9%（7/18），8个家庭中的7个家庭有2人及以上HBV感染或曾经感染，8个家庭共26名家庭成员中HBsAg阳性率高达53.8%（14/26），均证明HBV感染存在明显的家庭聚集性，与上海[11]、贵州[12]等地区相关调查结果一致。

本研究结果显示，一级亲属中母亲HBsAg阳性率高达71.4%（5/7），提示此次调查学生HBV感染的主要原因是母婴垂直传播，与我们前期的研究结果[8, 13-14]一致。加强阻断HBV母婴传播仍是乙型肝炎防控的重中之重。本研究8个家庭中有5个家庭的父母亲均接受了调查，未见夫妻均为HBsAg阳性的情况，提示性传播非此次调查家庭中HBV传播的主要途径。结合26名家庭成员中仅6名接种过乙型肝炎疫苗，提示对HBV感染者共同生活的家庭成员及时接种乙型肝炎疫苗，并做好日常生活中的预防，对于进一步做好阻断因生活中密切接触导致的HBV感染意义重大。

HBV基因型是一个重要的病毒学特征，导致不同的病毒变异谱。在中国以HBV B和C基因型为主，不同基因型具有不同的致病特点，HBV C2增加HCC发生的危险性，而HBV B2与HCC的复发相关[15-16]。海军军医大学（第二军医大学）相关项目组前期研究结果表明，在“HBV慢性感染―肝硬化―HCC”的发展进程中，HBV突变存在热点突变（突变频率＞10%）逐渐累积的现象，这部分突变可以用来监测和预警HCC的发生[17]。在母婴垂直传播中，HBV野生型更容易传给子代，而变异型都是之后在环境和遗传交互作用下被免疫选择出来的[8]。即HCC相关的HBV变异，如G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、A1762T/G1764A、G1896A、PreS deletion、C2964A、C3116T、C7A、C76A/T等变异都能增加患HCC的风险，成为HBV基因变异研究的热点。HBV BCP区受增强子Ⅱ及增强子Ⅰ（nt.1070-1234）部分调节，控制前C区（nt.1814-1900）mRNA或前基因组RNA的转录[18]。此外，HBV基因型C、HBV病毒含量（≥104 copy/mL）、丙氨酸转氨酶（＞45 U/L）等病毒学特征也是HCC的危险因素[4-5, 19-20]。

本研究发现，4组家庭母亲与子女HBV基因中，有3组同属于C型，母婴传播的可能性较大。但有1组母亲是C型、子女是B型，且该B型在HCC相关HBV热点突变位点上的进化程度略高于其他组子女，怀疑非母婴传播感染，而是由后天血液传播等其他方式造成。

本研究还发现，在不区分基因型的基础上，子女的热点突变频率均低于母亲，说明其在病毒进化程度上低于母亲，符合HBV进化的规律。但目前中国HBV所致HCC的发病率男女比为3:1，说明女性可能在病毒免疫选择进化或其他方面能力比较低[21]。

在中国大陆地区HBV的主要流行基因型为B和C型，B型更容易造成青少年急性乙型肝炎，但其导致乙型肝炎慢性化和致癌的效能比C型低；C型感染后较B型乙型肝炎慢性化比例相对更高，且容易发展为HCC[15-16]。本研究结果显示，C型的母亲与子女HBV突变差异普遍较大，原因可能是列选的均是C型与HCC相关的HBV基因的热点突变，这些突变是在长期慢性炎症刺激下选出的与HCC密切相关的突变位点，所以子女中大部分没有出现类似突变。

综上所述，本研究探索了外来务工人员家庭内HBV感染状况以及HCC相关的HBV变异情况，为进一步认识HBV感染的家庭聚集性、HBV变异发生规律、制定相关干预措施以预防HBV慢性感染导致的HCC提供了科学依据。

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