美国心理学家詹姆斯和丹麦生理学家朗格分别在1890年和1885年独立提出了相似的学说，合称为詹姆斯-朗格学说^[1]，认为内脏反应提供了情绪体验的信号，人体内的物质是某些行为产生的物质基础。睾酮是一种类固醇激素，由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，肾上腺亦分泌少量睾酮，对健康有重要的影响，具有增强性欲、力量、免疫功能、骨密度、神经兴奋和攻击性等作用，同时对人的心理亦有一定的影响^[2]。皮质醇（氢化可的松）是一种由肾上腺分泌的激素，对应激反应灵敏，在情绪紧张、受伤、疲劳、生病、训练负荷较高等情况下都可能会升高，可用来评价生理应激和心理应激^[3-4]。因此，检测睾酮与皮质醇的水平对于了解机体情绪体验和心理应激状态具有重要意义。

唾液样本容易采集，常作为无创检测的重要标本来源^[5]。唾液睾酮与血液睾酮相关性极好，血浆游离睾酮向唾液睾酮转运相当迅速，且唾液流出速率对游离睾酮浓度无影响^[6]。唾液皮质醇水平在室温下也相对稳定，不受皮质类固醇结合球蛋白和唾液流量的影响^[7]。早期多采用放射免疫分析法和酶免疫分析法检测体内睾酮和皮质醇水平，其缺点是与其他类固醇的交叉反应太多、缺乏标准化等；气相色谱-质谱联用法灵敏度较好，但生物样品预处理比较复杂^[8]；高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）虽然能够提供更高的特异性，却没有足够的灵敏度。采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法检测皮质醇和睾酮的含量，特异性和灵敏性都较高^[9-12]。由于唾液是比较干净的样品基质，样品可以是经初步提取的，也可以稀释后再进样。本研究拟建立一种简便、高效、快捷的LC-MS/MS方法，用于从唾液中检测睾酮和皮质醇的含量。

Agilent 6410A型三重四极杆串联质谱仪，包括Agilent 1200 G1311A四元泵、G1322A真空脱气机、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱，使用MassHunter软件控制系统及数据处理（美国Agilent公司）；VORTEX MIXER旋涡混合器（美国Labnet公司）；Centrifuge 5810R台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）；CPA225D电子分析天平（德国Sartorius公司）；科导SK7200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；VARIAN Bond Elut Plexa固相萃取小柱（美国Varian公司）。

皮质醇（上海源叶生物科技有限公司，B21001-20 mg），睾酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，164410050），卡马西平（内标，大连美仑生物技术有限公司，M1001AS-100 mg），甲醇、乙腈、甲酸为HPLC级（美国默沙东公司）。本实验取样对象来自10位健康受试者，男女各半。

使用Agilent ZORBAX SB-C₁₈（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱，采用乙腈:0.1%甲酸水溶液（60:40）的流动相，流速为0.3 mL/min，进样量为10 μL，柱温为25 ℃，每个样品的分析周期为3 min。

采用电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），正离子多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式。氮气作为雾化气和干燥气；高纯氮气为碰撞气，压力是0.1 MPa；雾化气压力为40 psi（1 psi＝6 894.8 Pa），干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10.0 L/min；毛细管电压为40 V（表 1）。

表 1 (Tab 1)

表 1 睾酮、皮质醇和内标的质谱检测参数 目标化合物 母离子m/z 子离子m/z 碰撞诱导解离能量(V) 碰撞能量Q/eV 睾酮 289.2 109.1 170 16 皮质醇 363.2 147.2 150 22 卡马西平 237.1 194.0 100 18

表 1 睾酮、皮质醇和内标的质谱检测参数

精密称取睾酮、皮质醇适量（约2.0 mg），分别置于2 mL的容量瓶中，用纯甲醇溶解，制得质量浓度为1.06 mg/mL的标准储备液，将储备液分装，放置在－20 ℃冰箱冷冻保存。

精密称取卡马西平标准品约2.0 mg，置于2 mL的容量瓶中，用纯甲醇溶解，制得质量浓度为1 mg/mL的内标储备液，用纯甲醇稀释至质量浓度为1 ng/mL的内标溶液。

取400 μL唾液，21 912.8×g离心10 min，将上清液唾液样品经OMGEA NANOSEP 10K超滤管21 912.8×g超滤10 min后，取上清液200 μL，加入20 μL内标溶液（卡马西平，1 ng/mL）混合，再加200 μL流动相混合，取10 μL进样，用峰面积内标法定量分析。

将按1.5项方法处理好的6个来自不同个体的空白基质和标准添加样品进样，比较标准添加样品和唾液的色谱图，比较睾酮、皮质醇和内标的出峰时间，考察唾液中的杂质成分是否存在干扰。

因睾酮和皮质醇是内源性激素，体内本身就有，所以空白唾液很难获得，查文献也无可靠有效的空白唾液替代物，通过实验比较选择用水代替空白唾液制备标准曲线。精确吸取各标准贮备液适量于1.5 mL离心管中，在空白基质中加入各对照品适量，睾酮和皮质醇在0.1~10.0 ng/mL的线性范围内（0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL）。取LLOQ浓度方法学样品进行定量下限考察，连续测定3 d，每天测定6批，LLOQ的响应值应为空白基质干扰物响应值的10倍以上（信噪比≥10），且精密度表示为相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）应≤20%，准确度应在－20%~20%范围内。

按1.5项下的方法制备0.2、1、5 ng/mL质量浓度的水标样品，按1.3项下条件分析，计算日内和日间精密度。

本研究分别考察了0.2、1、5 ng/mL质量浓度的水标样品，经样品预处理后分别在0 h和12 h后取样分析，考察其在室温下的稳定性；将样品放置在－20 ℃冰箱中，反复冻融3次后按1.3项下条件测定其质量浓度，考察其冻融稳定性。

睾酮、皮质醇和内标卡马西平峰形良好，睾酮保留时间约为2.2 min，皮质醇保留时间约为1.2 min，内标卡马西平保留时间约为1.3 min（图 1），唾液中内源物和杂质均不干扰药物的测定。

图 1 睾酮和皮质醇的液相色谱-串联质谱图 A:空白基质; B:空白基质添加内标卡马西平(1 ng/mL)、睾酮和皮质醇; C:实测样品

睾酮和皮质醇的线性范围为0.1~10 ng/mL，线性回归采用1/χ²加权最小二乘法来进行处理，其相关系数r分别为0.996 1和0.993 6，均大于0.990。两者的标准曲线分别为Y＝0.204 8X+0.185 3和Y＝0.095 2X+0.051 5，在线性浓度范围内线性关系良好。按信噪比≥10计算，LLOQ为0.1 ng/mL，批内、批间精密度RSD均＜15%，准确度在－20%~20%范围内，符合相关要求。

睾酮和皮质醇的日内与日间精密度均＜15%，结果见表 2。符合分析生物样品的检测要求。

表 2 (Tab 2)

表 2 睾酮和皮质醇唾液样品测定的精密度 n＝5 分析物 实际值 ρB/(ng·mL－1) 日间精密度 日内精密度 测得值ρB/(ng·mL－1), x±s RSD (%) 测得值ρB/(ng·mL－1), x±s RSD (%) 睾酮 0.2 0.21±0.02 7.2 0.22±0.01 2.7 1 0.92±0.06 6.9 0.90±0.02 2.5 5 5.14±0.42 8.1 4.96±0.37 7.5 皮质醇 0.2 0.21±0.02 8.3 0.21±0.02 10.3 1 0.95±0.09 9.0 0.99±0.06 6.2 5 4.87±0.31 6.3 4.87±0.31 6.5 RSD:相对标准偏差

表 2 睾酮和皮质醇唾液样品测定的精密度

睾酮和皮质醇在水中的稳定性符合生物样品的分析要求，结果见表 3。

表 3 (Tab 3)

表 3 睾酮、皮质醇在唾液中的稳定性 n＝3 分析物 实际值 ρB/(ng·mL－1) 3次冻融 室温放置12 h 测得值ρB/(ng·mL－1), x±s RSD (%) 测得值ρB/(ng·mL－1), x±s RSD (%) 睾酮 0.2 0.20±0.01 6.7 0.20±0.01 6.75 1.0 0.89±0.05 5.2 0.94±0.06 6.22 5.0 5.12±0.17 3.4 5.30±0.42 7.89 皮质醇 0.2 0.21±0.01 6.1 0.21±0.02 9.54 1.0 0.99±0.11 11.1 0.99±0.02 2.42 5.0 4.97±0.23 4.6 4.77±0.20 4.21 RSD:相对标准偏差

表 3 睾酮、皮质醇在唾液中的稳定性

将10例健康人唾液样品按1.5项下条件预处理，按1.3项下条件测定，测得值代入当日标准曲线，计算睾酮皮质醇浓度，结果如表 4所示。

表 4 (Tab 4)

表 4 睾酮和皮质醇在健康受试者唾液中的质量浓度 ρB/(ng • mL－1) 样本编号 睾酮 皮质醇 1 0.13 0.10 2 0.15 0.14 3 1.48 0.57 4 0.16 0.26 5 0.13 0.24 6 0.11 0.19 7 0.12 0.46 8 0.15 0.32 9 0.17 0.21 10 0.16 0.38

表 4 睾酮和皮质醇在健康受试者唾液中的质量浓度

本实验运用ESI正离子模式检测睾酮和皮质醇含量，通过优化电离使碎片离子呈规律的峰，便于质谱测定内源性物质的含量。采用串联质谱作为检测器的优势在于可以根据特定物质的母离子、子离子选择性地检测几种化合物，故液相质谱联用的选择性相对很高，对色谱柱的分离要求不是很高，使得检测快速、准确。本实验对碰撞能量进行了优化，MRM模式下条件为：睾酮289.2→109.1（CE16），皮质醇363.2→147.2（CE22），卡马西平237.1→194.0（CE18）。

调节流动相中有机相和水相的组分和比例，先后尝试在流动相中加入0.1%甲酸水溶液和乙腈在不同比例（5:5，4:6，3:7，2:8）下进行摸索，结果显示用Agilent ZORBAX SB-C₁₈（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）色谱柱、流动相0.1%甲酸水溶液和乙腈比例为4:6，可以得到较好的峰面积和更好的保留时间。

尝试了多种样品前处理方法，如加入乙酸乙酯的溶剂萃取、固相萃取、选用不同的蛋白沉淀剂、加入活性炭的吸附处理等，最终考虑到成本、处理干净和效率，选择了低温高速离心和超滤相结合的方式，减少唾液中的杂质及其他内源性物质对化合物检测的影响。

尝试了双氢睾酮、可的松、地塞米松、6-羟基睾酮和卡马西平等，最后优选卡马西平作为内标，该药物与睾酮、皮质醇出峰时间相近而且响应很好，并且在唾液中未被检测到，符合作为内标的条件。

本研究建立了一种快速、灵敏、简便的LC-MS/MS测定唾液中睾酮和皮质醇含量的方法，采用离心法和过滤法结合处理唾液样品简单、快速且经济；2种内源性物质和内标能够实现基线分离，其测定不受唾液中内源性物质的干扰，具有很好的专属性；方法学验证表明睾酮和皮质醇的线性、精密度和稳定性均符合分析的要求。样品的前处理十分便捷、经济，适用于批量样本的测定。