骨肉瘤是一种好发于青少年的骨原发性恶性肿瘤。虽然目前可以通过化学治疗、放射治疗或手术联合进行治疗，但骨肉瘤患者预后仍然很差，5年存活率不到20%^[1]。越来越多的研究表明，微RNA（microRNA，miRNA）在骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭中扮演着一个关键角色，明确miRNA在骨肉瘤中的作用对其诊断和治疗具有重要意义^[2-3]。Let-7d在肿瘤的发生、发展过程中扮演抑癌基因的角色，其通过调控多个原癌基因的表达水平在肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管生成和转移过程中发挥重要作用^[4-5]。为了明确let-7d在骨肉瘤发展中的作用，本实验研究了let-7d在骨肉瘤中的表达，以及其对人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，为骨肉瘤的治疗提供新的思路。

收集2010年至2015年在济南军区总医院脊髓修复科进行手术切除的25例骨肉瘤患者的肿瘤组织及相应的癌旁正常组织（距肿瘤组织边缘＞5 cm）标本，其中男性14例、女性11例，年龄为13~62岁，平均年龄为（18.21±11.72）岁。标本收集后置于－80 ℃保存。所有患者术前均未进行放射治疗或化学治疗，并知情同意。本研究获得济南军区总医院医学伦理委员会审批。

人骨肉瘤细胞系U2OS（货号TCHu88）、MG63（货号TCHu124）、SAOS2（货号TCHu114）和人成骨细胞系hFOB1.19（货号GNHu14）购自中国科学院上海细胞库，143B细胞由本实验室保存。所有细胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养液（均购自美国Invitrogen公司）于37 ℃、5% CO₂条件下培养。由华大基因公司合成的hsa-let-7d序列（5′-AGA GGU AGU AGG UUG CAU AGU U-3′）被重组到含有嘌呤霉素筛选标签的慢病毒载体pCDH中（本实验室保存）。用Lipofectamine^TM 2000试剂盒（美国Invitrogen公司）将重组载体pCDH-let-7d和慢病毒包装质粒（psPAX2和pMD2.G）共转入人胚肾细胞293FT，6 h后更换新鲜的DMEM培养液，48 h后收集产生的含有let-7d的慢病毒颗粒。用慢病毒颗粒感染U2OS细胞48 h，之后再用5 μg/mL的嘌呤霉素筛选，72 h后得到稳定过表达let-7d的U2OS细胞。对照组细胞为感染pCDH空病毒载体的U2OS细胞。

按照TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）说明书提取细胞总RNA。采用Quanto-miR cDNA合成试剂盒（北京旷博生物技术股份有限公司）进行反转录反应，合成miRNA cDNA。以β-actin为内参照基因，使用SsoAdvanced^TM SYBR^® Green Supermix试剂盒（美国BioRad公司）进行qPCR扩增。每个检验指标设3个复孔，用2^－ΔΔCt法相对定量let-7d表达水平。Hsa-let-7d引物序列为：正向5′-TGA GGT AGT TGG TTG TAT GGT T-3′，反向5′-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3′；Rhotekin（RTKN）基因：正向5′-AAA GGT GCT GGC ATA GGA TCT GC-3′，反向5′-TGG TTG ATG TGG GAG TCA CAA-3′；β-actin：正向5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′，反向5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′。

用CCK-8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）进行细胞增殖检测。将细胞以2×10⁴/mL密度接种于96孔板，培养0、12、24、36和48 h进行检测，每个时间点设5个复孔。检测时，每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，用酶标仪（美国BioTek公司）测定450 nm波长处的光密度（D）值。

将细胞接种于24孔板，每组设3个复孔，待生长至100%融合时用无菌移液器枪头沿培养板底部呈“1”字形划痕，PBS洗去脱落的细胞，于倒置显微镜下测量并记录划痕宽度，48 h后观察划痕修复情况。实验重复3次。

采用美国Corning公司8 μm带基质胶Transwell小室，下室中加500 μL含10%胎牛血清的DMEM培养液，上室中加入100 μL含有2.0×10⁵个细胞的DMEM培养液，在37 ℃、5% CO₂的培养箱内培养，24 h后用棉签刮除上室底部基质胶，用PBS漂洗上室表面3次，－20 ℃预冷的4%多聚甲醛溶液固定细胞20 min，PBS洗3次后用0.1%结晶紫染色10 min。每组细胞在显微镜下随机选取5个视野观察并计数细胞。实验重复3次。

用RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白，用BCA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）进行蛋白定量。用4%~12%的NuPAGE^® Novex Bis-Tris梯度胶（美国Invitrogen公司）电泳分离蛋白，每孔加样总蛋白量为50 μg。浓缩胶60 V 1 h，分离胶100 V 2 h，常规湿法转膜90 min，5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h后加入RTKN抗体（ab154954，英国Abcam公司，稀释比例为1:1 000）和GAPDH抗体（ab8245，英国Abcam公司，稀释比例为1:1 000），4 ℃过夜孵育。TBST漂洗3次，加入二抗稀释液孵育90 min，TBST洗涤3次，ECL化学发光显影、拍照。

运用miRNA靶基因在线预测软件TargetScan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/）、miRanda（http://34.236.212.39/microrna/home.do）和PicTar（http://www.pictar.org/）进行预测，将在至少3个软件中有交集且与细胞增殖、迁移和侵袭功能密切相关的基因作为let-7d可能的靶基因。

将293FT细胞接种24孔板（1.5×10⁵/孔），待细胞生长到融合度约80%时，按照脂质体Lipofectamine^TM 2000试剂盒说明书，分别用pCDH+pGL3-RTKN-wt、pCDH-let-7d+pGL3-RTKN-wt、pCDH-let-7d+pGL3-RTKN-mut质粒共转染293FT细胞，6 h后更换新鲜DMEM培养液。转染48 h后，按双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Promega公司）说明书进行检测，以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示各组细胞的荧光强度。

RTKN siRNA靶序列的设计与合成由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成，siRTKN-1序列：5′-GGA GTT GCA GAG GAA GCT A-3′，siRTKN-2序列：5′-AGC AUC AGU AAC CAG UAU GTT C-3′。待细胞生长至融合度为50%时，按照脂质体Lipofectamine^TM 2000试剂盒说明书进行转染，转染48 h后进行后续实验。对照组为转染随机干扰序列siRNA-nt的U2OS细胞。

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。呈正态分布的计量数据以x±s表示，两组数据的比较采用t检验，多组数据的比较采用单因素方差分析。非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。检验水准（α）为0.05。

qPCR检测结果显示，25例骨肉瘤患者肿瘤组织中let-7d表达水平低于癌旁正常组织（U＝374.0，P＜0.01，图 1A），人骨肉瘤细胞U2OS、MG63、SAOS2和143B中let-7d的表达水平均低于人成骨细胞hFOB1.19（P均＜0.05，图 1B）。选取let-7d表达水平相对较低的U2OS细胞用于后续研究。

图 1 qPCR检测let-7d在骨肉瘤组织和人骨肉瘤细胞系中的表达 Fig 1 Expressions of let-7d in osteosarcoma tissues and osteosarcoma cell lines detected by qPCR A: The expressions of let-7d in osteosarcoma tissues and matched adjacent normal tissues (**P < 0.01. n＝25, median [quartile]); B: The expressions of let-7d in human osteosarcoma cell lines U2OS, MG63, SAOS2, 143B cells and human osteoblast cell line hFOB1.19 cells(*P < 0.05, **P < 0.01 vs hFOB1.19. n＝3, x±s)

采用qPCR验证发现稳定过表达let-7d的U2OS细胞系构建成功（P＜0.05，图 2A）。CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验结果（图 2B~2D）显示，与对照组相比，过表达let-7d组U2OS细胞增殖减慢，迁移能力降低，侵袭能力被抑制（P均＜0.05）。

图 2 过表达let-7d抑制U2OS细胞增殖、迁移和侵袭 Fig 2 Overexpression of let-7d inhibiting proliferation, migration and invasion of U2OS cells A: The expression of let-7d in let-7d overexpressing U2OS cells by qPCR; B: The proliferation of let-7d overexpressing U2OS cells by CCK-8 assay; C: The migration of let-7d overexpressing U2OS cells by scratch assay; D: The invasion of let-7d overexpressing U2OS cells by Transwell assay. *P < 0.05, **P < 0.01. n＝3, x±s. Scale bar＝100 μm

通过4个miRNA靶基因生物预测软件（TargetScan，miRWalk，miRanda，PicTar）对let-7d的靶基因进行预测发现，RTKN的3′UTR含有一个let-7d的结合位点，可能是let-7d的一个较好的靶基因（图 3A）。荧光素酶实验结果（图 3B）显示，let-7d可抑制RTKN-3′UTR-wt荧光酶活性，而不影响RTKN-3′UTR-mut荧光酶活性。qPCR检测发现，let-7d过表达U2OS细胞中RTKN的mRNA表达水平降低（图 3C）。这些结果提示let-7d可通过与RTKN-3′UTR的结合，负性调控骨肉瘤细胞中RTKN的表达，证明RTKN是let-7d的靶基因。

图 3 RTKN是let-7d的直接靶基因 Fig 3 RTKN is a direct target gene of let-7d A: Sequence alignment of let-7d and its conserved target site in RTKN-3′UTR; B: Relative luciferase activity in 293FT cells co-transfected with pGL3-RTKN-3′UTR-wt or-mut reporter plasmids containing let-7d potential binding sites (let-7d) or control plasmids (Ctrl); C: The RTKN mRNA expression in let-7d overexpressing U2OS cells by qPCR. **P < 0.01. n＝3, x±s

用两种RTKN特异性siRNA序列瞬时干扰U2OS细胞内RTKN的表达，通过蛋白质印迹法检测U2OS细胞内RTKN蛋白表达水平，选取抑制效果更明显的siRTKN-2序列进行实验（图 4A）。CCK-8实验结果（图 4B）显示，抑制RTKN表达后U2OS细胞增殖减慢（P＜0.05）。采用划痕实验和Transwell实验评估抑制RTKN对骨肉瘤细胞迁移、侵袭的影响，结果（图 4C、4D）显示抑制RTKN后U2OS细胞的迁移、侵袭能力均下降（P均＜0.05）。

图 4 下调RTKN抑制U2OS细胞的增殖、迁移和侵袭 Fig 4 Down-regulation of RTKN inhibits proliferation, migration and invasion of U2OS cells A: Expressions of RTKN in U2OS cells transfected with siRTKN-1 (1) and siRTKN-2 (2), and siRNA-nt (nt) detected by Western blotting; B: The proliferation detected by CCK-8 assay; C: The migration detected by scratch assay; D: The invasion detected by Transwell assay. *P < 0.05 (vs the same time point in control group in Fig 4B). n＝3, x±s. Scale bar＝100 μm

Let-7d作为let-7家族的重要成员，参与胰腺癌、前列腺癌及头颈部癌等多种肿瘤细胞的增殖、凋亡等生物学过程^[4-6]。这些生物学过程可能与let-7d调节细胞周期、分裂及凋亡相关的基因，如细胞分裂周期蛋白25A、细胞周期蛋白依赖性激酶6、细胞周期蛋白D1、caspase-3有密切关系^[6-7]。此外，let-7d还可通过靶向抑制Ⅲ型胶原蛋白α1和CC趋化因子7基因而抑制肾癌细胞的增殖、转移和肿瘤巨噬细胞的浸润^[8]。虽然let-7d通过靶向多种基因调控不同肿瘤细胞的功能，但其对介导骨肉瘤细胞增殖、迁移的机制并不明确。因此，本研究通过构建稳定过表达let-7d的骨肉瘤细胞系，证明了let-7d可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭；并应用生物信息学技术和双荧光素酶实验验证了RTKN是其下游靶基因，且下调RTKN表达同样能够抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，可以推测let-7d抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移是通过下调RTKN所导致的。

RTKN是一种小GTP结合蛋白，可通过与活化型Rho分子结合调控细胞生长、分化和凋亡^[9]。最近研究表明，RTKN在多种恶性肿瘤中呈高表达，并与肿瘤细胞的浸润转移和患者不良预后关系密切^[10-11]。这可能与RTKN激活NF-κB信号通路、诱导抗凋亡蛋白杆状病毒凋亡蛋白抑制因子重复序列3、B细胞淋巴瘤因子2（B cell lymphoma 2，BCL2）样蛋白1、BCL2相关蛋白A1和BCL2相关蛋白A20的表达密切相关^[12]。在本实验中，下调RTKN表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，虽然尚不能明确RTKN对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用是否与上述信号通路有关，但是本实验仍然从一个全新的方向阐述了骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制，并为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。