胆管癌（bile duct carcinoma）是一类恶性程度非常高的肿瘤，预后极差，5年生存率低于20%，其发病因素复杂，包括原发性胆汁性肝硬化、肝炎、先天性胆管扩张和致癌物的刺激等^[1-2]。由于胆管癌的基础研究相对缓慢，目前缺乏新的治疗手段和方法。因此，预防胆管癌的发生尤为重要。化学预防是利用已知的小分子化合物或天然分子干预高风险人群，以减少肿瘤的发病率^[3-4]。目前已知的化学预防药物包括二甲双胍、阿司匹林和中药等，其中阿司匹林长期应用可降低心血管疾病和结直肠癌的发病率^[5]，其与胆管癌发病风险的相关性受到广泛关注^[6]，但仍缺乏其体内抑制胆管癌发生的直观体现。本研究构建了胆管癌诱导成瘤模型，并利用阿司匹林干预该模型，旨在探讨阿司匹林能否降低胆管癌的发生率。

6个月龄SD雄性大鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2012-0002，使用许可证号：SYXK（沪）2012-0002]，饲养于同济大学附属东方医院实验动物中心。硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）购于常州航宇医药技术开发有限公司（CAS号：27366-72-9）；阿司匹林购自生工生物工程（上海）股份有限公司（MDL编号：MFCD00002430）。胆管癌细胞QBC939为本实验室保存。碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 2，CA-2）抗体（PB1045）和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（BA1054）购自武汉博士德生物工程有限公司；SP免疫组织化学试剂盒（KIT-9720）购自福州迈新生物技术开发有限公司。RIPA裂解液（P0013B）购自于上海碧云天生物技术有限公司。

选取15只SD雄性大鼠，每天予以饮用含TAA浓度为300 mg/L的饮用水，饲养于SPF级动物房，分别于喂养第8、12、16周处死2只大鼠，手术切取肝脏，肉眼观察肝脏表面和切面情况，随后石蜡包埋、固定、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining，H-E）染色、病理切片，显微镜（OLYMPUS，BX53）下观察肝脏病变情况；第20周时处死剩余大鼠，处理方式同前，观察肝脏病变情况。

根据文献[7]和本研究可确定第12~16周是胆管癌发生的关键节点，在此节点予以干预可有助于阻断胆管癌的演变，故采用阿司匹林在此节点加以干预。选取20只SD雄性大鼠，300 mg/L TAA饲养12周后停用，将大鼠分为对照组和阿司匹林处理组，每组10只。阿司匹林处理组大鼠予以含有阿司匹林（250 mg/kg）的饮用水灌胃饲养，对照组予以常规饮用水。饲养3个月后，各组分别处死3只大鼠取肝脏，肉眼和显微镜下观察肝脏及切面的肿瘤形成情况；第6个月时处死剩余大鼠，行H-E染色观察肝脏表面及切面的肿瘤形成情况。

取各组大鼠肝脏，根据SP免疫组织化学试剂盒说明书操作检测肝脏病变组织CA-2的表达情况，以PBS替代一抗为阴性对照。CA-2阳性染色为棕黄色或棕褐色，定位于细胞质膜。选取5个以上高倍镜视野计数阳性细胞所占比例，＜5%定义为阴性，≥5%为阳性。

取胆管癌细胞QBC939以1×10⁶/mL的密度种植于6孔板，予以阿司匹林5 mmol/L处理，对照组加入等量无血清DMEM，培养48 h后用RIPA裂解液裂解细胞并收集蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取50 μg，变性后行十二烷（基）硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后的蛋白转移至PVDF膜，封闭液封闭过夜（4 ℃），分别加入抗CA-2一抗（1:500）和抗β-actin一抗（1:1 000）室温孵育3 h；Tris缓冲生理盐水（TBS）洗涤3次，分别加入相应二抗（1:2 000）室温孵育2 h，TBS洗涤3次，X线曝光显色。

采用SPSS 11.0软件行数据处理。所有资料以x±s表示，组间比较采用两样本均数比较的t检验。检验水准（α）为0.05。

TAA喂养8周后，大鼠肝脏形态仍正常，镜下未见明显异常；12周时大鼠肝脏形态大体正常，镜下可见散在纤维组织增生；16周时大鼠肝脏形态发生变化，表面出现黑斑，可见肿瘤形成，切面可见大量纤维组织增生和胆管癌形成；20周时大鼠肝脏体积缩小，颜色变为枯黄色，所有大鼠肝脏表面和切面均形成肉眼可见的肿瘤，镜下可见大量汇管区结缔组织增生、胆管细胞异型增生和肿瘤形成（图 1A、1B）。与第8周时相比，第20周时大鼠肝内肿瘤数目增加，差异有统计学意义（P＜0.05，图 1C）。

图 1 TAA诱导大鼠肝内胆管癌的发生过程 Fig 1 Thioacetamide (TAA) induces the development of intrahepatic bile duct carcinoma in rats A: Liver surface and cut surface of rats exposed to TAA at different time points (red circles show tumor); B: H-E staining revealing liver lesions induced by TAA at different time points (red circles show tumor, original magnification:×100); C: The average number of tumor nodules in livers (*P＜0.05. x±s)

饲养3个月后，对照组大鼠肝脏出现少许纤维组织增生和个别疑似肿瘤，而阿司匹林处理组大鼠肝脏未见明显异常。第6个月时，对照组所有大鼠肝脏切面可见胆管扩张、纤维组织增生以及恶性肿瘤和疑似肿瘤的形成，成瘤率为100%（7/7）；而阿司匹林处理组中只有2只大鼠肝脏出现少许纤维组织增生和疑似肿瘤，成瘤率为28.6%（2/7），见图 2。阿司匹林处理过程中未见药物所致的大鼠死亡。

CA-2阳性染色为棕黄色或棕褐色，定位于细胞质。TAA喂养8周后，大鼠肝脏病变组织中CA-2的表达较低，而随着病情进展，CA-2的表达逐渐升高，第12、16、20周时TAA诱导形成的肝脏肿瘤组织中CA-2均呈阳性表达（图 3A）。饲养3个月后，对照组大鼠肝脏肿瘤组织中存在CA-2的过度表达，而阿司匹林处理组大鼠肝脏组织中CA-2的表达减弱（图 3B）。

图 2 阿司匹林中断或延缓胆管癌进展 Fig 2 Aspirin interrupts or delays the progress of bile duct carcinoma A-C: A large number of bile duct dilation (A), tumor formation (B) and fibrosis (C) were found in livers of rats in control group; D-E: No apparent abnormality (D) was found in livers in aspirin treatment group, except for two cases of visible tumor (E). H-E staining. Original magnification: ×200

图 3 阿司匹林抑制TAA诱导的肝脏病变组织中CA-2的表达 Fig 3 Aspirin inhibits expression of CA-2 in liver lesions induced by thioacetamide (TAA) A: Liver lesions of rats exposed to TAA at different time points; B: Liver lesions of rats treated with aspirin for 3 months after exposure to TAA for 12 weeks. CA-2: Carbonic anhydrase 2. Immunohistochemical staining. Original magnification: ×200

蛋白质印迹结果（图 4）显示，5 mmol/L阿司匹林处理胆管癌细胞48 h后，细胞中CA-2的表达下调，与未处理对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。

图 4 阿司匹林抑制胆管癌细胞QBC939中CA-2的表达 Fig 4 Aspirin inhibits expression of CA-2 in bile duct carcinoma QBC939 cell lines CA-2: Carbonic anhydrase 2. **P < 0.01. n＝3, x±s

近年来胆管癌的发病率逐年增高，除炎症等因素外，化学致癌物的持续刺激是重要诱因^[8]。化学致癌物诱发的肿瘤突变谱系明显，以T＞C和C＞T突变为主^[9]，容易构建相关模型，在该模型上进行预防实验和干预实验能很好地模拟人体肿瘤特点。本研究成功构建了TAA诱导的胆管癌模型，并在此模型基础上实现了阿司匹林的肿瘤预防实验。

胆管癌常见动物模型包括裸鼠皮下成瘤模型、原位种植模型和药物诱导模型^{[7, 10-11]}。基于裸鼠的成瘤模型成瘤时间短，便于观察基因或药物的功效，但其缺乏细胞免疫，生存周期短，不利于长期观察，难以行干预性研究。TAA是一种化学制剂，广泛用于生产催化剂、稳定剂、阻聚剂、电镀添加剂、照相药品、农药、染色助剂和选矿剂等，其长期蓄积易损伤肝脏。腹腔注射或口服一定剂量的TAA后，大鼠肝硬化的发生率高达80%，其特征表现为中央静脉周围炎性细胞浸润、肝细胞气球样变、肝细胞变性坏死、纤维组织增生且向肝小叶内延伸，最终形成纤维间隔；而随着TAA用药时间的延长，最终导致肝癌和（或）胆管癌的发生^[12]。TAA诱导的肝纤维化/肿瘤模型的机制可能为TAA影响了肝细胞DNA、RNA和蛋白质合成，致使肝代谢紊乱、毒性蓄积，进而导致肝纤维化以及肿瘤的发生^[13]。Yeh等^[7]通过改变TAA的给药剂量、方式和时间，建立了稳定的胆管癌动物模型；TAA饮用9周时大鼠出现胆管上皮异型增生，16周时出现侵袭性肠型胆管癌，22周时所有大鼠均出现肠型胆管癌，成瘤率高达100%。本研究中TAA诱导12周时有大鼠出现胆管上皮增生和肝内局灶性纤维化，16周时大鼠肝内出现大量纤维化和非侵袭性胆管癌，20周时所有大鼠出现侵袭性肠型胆管癌，成功复制了胆管癌大鼠模型，而且TAA诱导的胆管癌与人类肝门部胆管癌极为类似，肿瘤细胞分化较好，形成腺腔，大量纤维组织增生和炎性细胞侵犯。该模型为胆管癌的基础和临床研究提供了理想平台。

化学预防是降低肿瘤发病率的必要手段^[14]。用于化学预防的药物要求安全、无毒副作用、可长期服用，目前常用的药物包括阿司匹林、二甲双胍和中药等，其中对阿司匹林的研究最深入细致、跨度最广。阿司匹林预防结直肠癌的作用已得到验证，其对其他恶性肿瘤发病风险的防控作用也逐渐受到关注^[5]。Choi等^[6]调查发现阿司匹林的长期应用使胆管癌的发生率降低了2.7~3.6倍。高风险人群是指接触化学致癌物一段时间后的人群，即使脱离化学致癌物，也仍然易患肿瘤，因此提前予以化学药物干预疾病进展尤为必要。本研究结果显示TAA诱导的模型中第12周是胆管癌发生的关键节点，如果此时加以干预可以模拟上述环境，对于中断或延缓胆管癌的发生具有重要指导意义，因此在TAA处理大鼠12周后给予阿司匹林预防。结果发现经过6个月的干预，阿司匹林处理组大鼠的肿瘤发病率仅为28.6%（2/7），而对照组所有大鼠均形成了镜下可见的肿瘤，表明阿司匹林能在一定程度上中断TAA诱发的胆管癌的发生。

阿司匹林抗肿瘤机制的研究较为深入，其可以抑制环氧合酶、核因子κB和Bcl-2基因活性，上调Bax基因表达，激活死亡受体和抑制血小板聚集等^[15]。此外，阿司匹林还能调控多种肿瘤代谢通路，发挥其抗肿瘤和延缓衰老的作用^[16-18]。CA是一种含锌酶，参与多种生理病理过程，如尿素生成、糖异生和脂肪生成等，部分CA在肿瘤的发生和发展过程中也起到重要作用^[19]。CA-2是CA家族成员之一，其在鼻咽癌和膀胱癌组织中高表达^[20-21]。本研究发现在病变肝脏和TAA诱导的胆管癌组织中CA-2均呈现高表达，提示CA-2可能参与了TAA诱导的胆管癌的发生。CA-2与血栓性疾病中阿司匹林的耐药相关^[22]，而本研究发现在肿瘤细胞中阿司匹林也能降低CA-2的表达，动物研究也证实阿司匹林降低肿瘤发生的同时降低了CA-2的表达，提示CA-2可能是阿司匹林的潜在作用靶点，阿司匹林通过降低CA-2的表达延缓TAA诱导的胆管癌的发生。

综上所述，TAA能成功诱导胆管癌的发生，其构建的胆管癌模型是研究胆管癌预防和治疗的理想平台。阿司匹林能中断或延缓胆管癌的发生，其作用可能是通过降低CA-2的表达实现的。