冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）作为辅助生殖助孕中重要的衍生技术之一，可避免体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）周期卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS），且子宫内膜过薄、子宫内膜息肉等不适合新鲜移植者也可行胚胎冷冻。新鲜胚胎周期移植未妊娠患者进行FET可有效提高临床累积妊娠率^[1]。对于FET周期中胚胎移植前卵裂期冻融胚胎进行体外培养的时间，各中心均有不同标准，冻融胚胎复苏后培养时间对临床妊娠率影响的相关研究结果也各不相同^[2-6]。本研究回顾性分析海军军医大学（第二军医大学）长海医院生殖医学中心接受FET助孕患者的FET周期资料，探讨卵裂期冻融胚胎复苏后，不同培养时间进行FET对临床妊娠率的影响。

选择2016年1月至12月于海军军医大学（第二军医大学）长海医院生殖医学中心接受FET助孕的不孕患者。纳入标准：FET周期；复苏冷冻胚胎为第3天卵裂期胚胎。排除标准：（1）因非胚胎因素放弃FET周期；（2）卵裂期冻融胚胎复苏后培养3 d，胚胎裂解无可用胚胎移植周期；（3）移植日子宫内膜偏薄（小于7 mm）。纳入患者均在医师充分告知后签署知情同意书。本研究通过海军军医大学（第二军医大学）长海医院医学伦理委员会审批。

上周期可用胚胎均采用玻璃化冷冻方法进行冻存。复苏日采用快速复温的方式复苏玻璃化冷冻的胚胎，复苏后重新评价胚胎；接受复苏后继续体外培养的胚胎在移植日再次评价胚胎，具体评价方法及优质胚胎定义同参考文献[7]。

既往月经周期规律的患者采用自然周期方案，月经周期不规律者采用激素替代或小剂量药物促排卵方案准备子宫内膜。（1）自然周期方案：既往月经周期规律者，在月经周期第10~12天开始用B型超声监测，当卵泡直径＞18 mm时予注射用绒促性素（国药准字H44020673，丽珠集团丽珠制药厂，2 000 U/支）6 000 U肌内注射诱排卵，排卵后开始口服黄体酮胶丸（国药准字H20031099，浙江爱生药业有限公司，100 mg/粒）100 mg/次、2次/d，并肌内注射黄体酮注射液（国药准字H44020229，广州白云山明兴制药有限公司，20 mg/支）40 mg/d或者阴道塞黄体酮阴道缓释凝胶（批号C1643C，英国Fleet Laboratories Limited，90 mg/支）90 mg/d。在黄体酮转化的第4天移植第3天胚胎，第5天移植桑葚胚，第6天移植囊胚。（2）激素替代方案：月经周期第3天开始口服戊酸雌二醇片（国药准字J20130009，法国DELPHARM LilleS.A.S.，1 mg/片），起始剂量为2 mg/次、1次/d，连用5 d后增加为2 mg/次、2次/d连用5d，用药第11天时用B型超声监测子宫内膜，如果内膜厚度＜7.5 mm，可加量至6 mg/d；或月经周期第3天开始于大腿内侧皮肤外涂雌二醇凝胶（H20090763，法国法杏制药厂，80 g/支），起始剂量为2.5 g/次、1次/d，5 d后增加为2.5 g/次、2次/d连用5 d，若用药第11天时子宫内膜厚度＜7.5 mm，可加量至2.5 g/次、3次/d。直至超声检查提示子宫内膜厚度≥8 mm时，开始给予黄体酮转化内膜，黄体支持方法同前。（3）小剂量药物促排卵方案：月经周期第5天开始口服来曲唑片（国药准字H19991001，江苏恒瑞医药股份有限公司，2.5 mg/片）2.5 mg/次、1次/d，连用5 d。第10天开始监测卵泡发育情况，若有优势卵泡出现，等待卵泡继续生长；若无优势卵泡，予注射用尿促性素（批号170604，丽珠集团丽珠制药厂，75 U/支）75 U/d，待优势卵泡直径≥18 mm后，予注射用绒促性素6 000 U肌内注射诱排卵，排卵后开始使用黄体酮，黄体支持方法同前。

根据胚胎复苏后至移植前体外培养的天数将患者分为3组：复苏后未培养组、复苏后培养1 d组、复苏后培养2 d组。

腹部超声引导下完成胚胎移植。妊娠标准：胚胎移植14 d后检测血清人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG），移植后30~35 d超声检查观察到妊娠囊为临床妊娠。

采用SPSS 18.0软件对数据进行分析。计量资料以x±s表示，3组间比较采用方差分析；计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。检验水准（α）为0.05。

3组患者一般情况见表 1。共692周期纳入研究，其中381周期复苏后未培养于当天移植，228周期复苏后培养1 d移植，83周期复苏后培养2 d移植。3组患者年龄、不孕年限、体质量指数（body mass index，BMI）、基础卵泡刺激激素、内膜准备方案的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表 1 (Tab 1)

表 1 3组一般情况比较 项目 复苏后未培养组 N＝381 复苏后培养1 d组 N＝228 复苏后培养2 d组 N＝83 F/χ2值 P值 年龄(岁), x±s 32.66±5.16 32.32±5.03 31.20±3.90 2.943 0.053 不孕年限(年), x±s 4.12±3.06 4.10±3.04 3.95±2.18 0.106 0.899 体质量指数(kg • m-2), x±s 22.28±3.41 22.06±2.72 21.41±3.46 2.215 0.110 基础卵泡刺激激素zB/(U • L-1), x±s 6.64±2.62 6.75±3.30 6.03±1.63 1.690 0.185 子宫内膜准备方案n (%) 4.400 0.355   自然周期方案 29 (7.6) 18 (7.9) 3 (3.6) 1.852 0.396   激素替代方案 318 (83.5) 197 (86.4) 75 (90.4) 2.933 0.231   小剂量药物促排卵方案 34 (8.9) 13 (5.7) 5 (6.0) 2.432 0.296

表 1 3组一般情况比较

复苏后未培养组、复苏后培养1 d组和复苏后培养2 d组复苏后存活的卵裂期胚胎数量分别为706、481和265枚，分别经过0、1、2 d体外培养后，胚胎丢失数分别为0枚（0.0%）、64枚（13.3%）、114枚（43.0%），3组间差异有统计学意义（χ²＝332.240，P＜0.01）；两两比较发现，复苏后培养1 d组胚胎丢失率高于复苏后未培养组（χ²＝99.291，P＜0.01），复苏后培养2 d组胚胎丢失率高于复苏后未培养组和复苏后培养1 d组（χ²＝344.114、83.035，P均＜0.01）。3组胚胎移植数及移植日子宫内膜厚度差异均无统计学意义（P均＞0.05）。3组优质胚胎移植率差异有统计学意义（χ²＝190.000，P＜0.01）；两两比较发现，复苏后未培养组优质胚胎移植率高于复苏后培养1 d组和复苏后培养2 d组（χ²＝156.614、106.660，P均＜0.01），复苏后培养1 d组和复苏后培养2 d组差异无统计学意义（χ²＝0.717，P＞0.05）。3组移植后临床妊娠率差异有统计学意义（χ²＝16.376，P＜0.01）；两两比较发现，复苏后未培养组与复苏后培养1 d组临床妊娠率差异无统计学意义（χ²＝2.562，P＞0.05），复苏后培养2 d组高于复苏后未培养组和复苏后培养1 d组（χ²＝16.118、7.433，P均＜0.01）。见表 2。

表 2 (Tab 2)

表 2 3组移植情况及妊娠结局比较 项目 复苏后未培养组 复苏后培养1 d组 复苏后培养2 d组 χ2/F值 P值 胚胎丢失率a % (n/N) 0.0 (0/706) 13.3 (64/481)** 43.0 (114/265)**△△ 332.240 ＜0.001 胚胎移植数x±s 1.85±0.36 (n=381) 1.83±0.38 (n=228) 1.82±0.39 (n=83) 0.475 0.622 移植日子宫内膜厚度d/mm, x±s 10.76±2.02 (n=381) 10.71±2.05 (n=228) 10.70±2.13 (n=83) 0.067 0.935 优质胚胎移植率a % (n/N) 83.1 (587/706) 47.7 (199/417)** 43.7 (66/151)** 190.000 ＜0.001 临床妊娠率% (n/N) 38.6 (147/381) 45.2 (103/228) 62.7 (52/83)**△△ 16.376 ＜0.001 a: N为复苏后存活胚胎数. **P＜0.01与复苏后未培养组比较; △△P＜0.01与复苏后培养1 d组比较

表 2 3组移植情况及妊娠结局比较

随着玻璃化冷冻技术的成熟，FET因其降低了OHSS风险而在辅助生殖技术领域发挥着重要作用。但有关复苏后移植前是否需要行体外培养及不同体外培养时间对移植后妊娠率的影响尚不明确，且相关研究极少。

罗金等^[8]和唐永梅等^[9]认为延长解冻后体外培养时间可淘汰一部分发育潜能差、自身发育异常或染色体异常胚胎。本研究也发现，随着复苏第3天卵裂期胚胎后培养时间的增加，胚胎丢失率增加。可见，卵裂期冻融胚胎复苏后体外培养时间延长可增加无发育潜能胚胎的剔除率，从而减少胚胎因素导致的助孕失败。理论上，通过增加胚胎体外培养时间筛选具有发育潜能的胚胎，有助于提高移植后临床妊娠率。

FET周期胚胎质量是影响FET临床妊娠率的重要因素。第3天卵裂期冻融胚胎在被复苏并经历2 d体外培养后，可达到囊胚期。近年来随着IVF-ET实验室技术的提高，囊胚体外培养体系逐渐优化，囊胚形成率逐渐提高。目前认为囊胚培养是筛选卵裂期具有优质潜力胚胎的重要方法，且具有更好的胚胎发育和子宫内膜的同步性。囊胚移植经历了严格的胚胎淘汰过程，因此与卵裂期胚胎相比，移植更有发育潜力的囊胚能获得更好的临床妊娠结局。本研究结果显示，尽管复苏后培养2 d组优质胚胎移植率低于复苏后未培养组，但卵裂期胚胎复苏后体外培养胚胎2 d（达到第5天囊胚期）组的临床妊娠率仍高达62.7%（52/83），远远高于复苏后未培养组（第3天卵裂期胚胎）及复苏后培养1 d组（达到第4天桑葚胚）。因此，对于第3天有效胚胎数目较多的患者，FET周期建议在卵裂期胚胎解冻后行囊胚培养，以提高临床妊娠率。

第3天卵裂期胚胎复苏后接受1 d的体外培养可形成桑葚胚，胚胎细胞在该时期会出现融合、半融合或者腔很小的囊胚，各细胞之间膜紧密连接形成的网状结构形成了胚胎骨架，可以抵御母体出现的一些剧烈变化，避免流产等不良反应，从而提高妊娠率^[10]。易艳红等^[11]研究也发现进行IVF-ET时，选择第3天胚胎解冻培养至桑葚胚期再行移植，能有效提高临床妊娠率，且不增加宫外孕、流产和早产的风险。本研究结果显示，复苏后培养1 d组优质胚胎移植率低于复苏后未培养组，虽然差异无统计学意义，但临床妊娠率增加，提示桑葚胚移植有利于提高临床妊娠率，考虑原因可能与桑葚胚本质是由具有发育潜能的卵裂期胚胎进一步发育而来有关，这种胚胎有进一步发育成囊胚的极大潜能。本研究中复苏后体外培养1 d增加胚胎丢失率，进一步提示复苏后培养1 d后可在一定程度上筛选更优质的胚胎，从而增加临床妊娠率。

综上所述，临床FET助孕治疗中，应根据患者的实际情况综合评价，进行个体化治疗，并与患者充分沟通交流，经过其知情同意后决定是否在复苏冻胚后继续体外培养及确定培养的时间，以减小患者经济及精神压力。本研究结果表明，解冻卵裂期胚胎进行体外培养1~2 d后移植，可以进一步筛选具有发育潜能的胚胎，并提高临床妊娠率。因此，对于有较多优质卵裂期胚胎的患者，建议在复苏后适当增加体外培养时间，从而筛选高发育潜能的胚胎，提高移植率和临床妊娠率。本研究为回顾性研究，且复苏后再培养有胚胎丢失风险，存在一定的偏倚，因此需要大样本、前瞻性的随机对照临床试验进一步验证。