2018, Vol. 39
2. 河北省人民医院体检中心, 石家庄 050051;
3. 河北省人民医院风湿免疫科, 石家庄 050051
2. Physical Examination Center, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China;
3. Department of Rheumatic Immunology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, Hebei, China
随着我国社会进步和物质生活的改善，冠心病（coronary heart disease, CHD）的发生率不断升高，已成为社会问题。冠心病的发生与遗传因素、肥胖、高血压等多种因素有关[1-4]。本课题组前期研究发现，人枯草溶菌素转化酶9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）基因突变可影响胆固醇代谢[5]，促进动脉粥样硬化形成。另有研究显示PCSK9第12外显子E670G位点突变与冠心病有关[6-8]。但目前有关PCSK9 基因D320N与冠心病病情的报道少见。本研究检测了PCSK9基因D320N突变在冠心病患者及正常对照组中的分布差异，同时检测了血清PCSK9浓度的变化，旨在探讨该位点突变与冠心病的关系。
1 资料和方法 1.1 研究对象选取2014年1月至2016年1月在河北省人民医院门诊就诊及住院的冠心病患者3 450例为病例组，所有患者均经冠状动脉CT或冠状动脉造影等确诊，由我院心内科医师确定冠心病类型。病例组男性2 047例，年龄29~74岁，平均（48.9±10.2）岁；女性1 403例，年龄31~74岁，平均（50.2±10.3）岁。同时选取1 100名同期健康体检者为对照组，性别、年龄与病例组匹配，排除肝炎、肝硬化、肾炎、肾病综合征、肾功能不全、先心病等疾病。所有入选者均签署知情同意书，本研究获得河北省人民医院伦理委员会审核批准。
1.2 血清采集入选者取空腹静脉血7 mL，其中2 mL置入EDTA-K2抗凝管中，混匀后-80 ℃保存，用于提取基因组DNA。另外5 mL放入促凝管中静置30 min，1 760×g离心15 min分离血清，置于-20 ℃以下保存，用于检测血清中血脂水平和PCSK9浓度。
1.3 外周血血清中血脂水平的测定取分离血清，使用Beckman AU5821全自动生化分析仪测定血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triacylglycerol，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平。
1.4 外周血血清中PCSK9浓度的检测选用人PCSK9 ELISA试剂盒（96T；KA1072，Abnova公司，美国），严格按照说明书要求操作，试剂标本平衡至室温，血清标本1:100预稀释备用。板内变异系数＜1.96%，板间变异系数＜4.32%，加标回收率为94.23%，检测范围为0.16~10.00ng/mL，最低检出限为0.154 ng/mL，用稀释液稀释标准品绘制标准曲线，使用酶免之星全自动酶标仪（瑞士Hamilton公司）检测各血清样本在450 nm处的光密度值，计算PCSK9浓度。
1.5 PCSK9基因D320N位点多态性分析采用PCR+直接测序法检测PCSK9基因第6外显子的基因序列，对D320N位点多态性进行分析。
1.5.1 提取冠心病患者及健康对照人群的基因组DNA取EDTA-K2抗凝血400 μL，按照TIANamp Genomic DNA kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒[离心柱型，DP304；天根生化科技（北京）有限公司]说明书要求提取基因组DNA。
1.5.2 PCR扩增目的基因片段应用生物学软件Primer 6.0设计引物序列，上游5′-AAA GGG GAG CAG GTC TCC C-3′，下游5′-GCC CGC CCT CCC TCC GCC CTC CG-3′。反应体系：1×PCR缓冲液5 μL，2.5 mmol/L MgCl2 2 μL，200 μmol/L dNTP（dUTP:dTTP＝1:9）2.5 μL，200 μmol/L上、下游引物各5 μL，5 U KOD plus（Pfu DNA聚合酶，日本Toyobo公司）2 μL，目标DNA 5 μL，加无菌水制成50 μL反应体系。使用Mastercycler® gradient PCR分析仪（德国Eppendorf公司）进行扩增。反应条件：20 ℃ 10 min裂解u-DNA；95 ℃ 10 min初始变形；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃扩增30 s，共35次循环；72 ℃ 10 min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证。
1.5.3 核苷酸序列分析应用3730XL全自动DNA测序仪（美国ABI公司）测定目标基因的序列，正反两方向测序。测序结果使用DNAMAN软件（V6.0.3.99汉化版）与GenBank、EMBL、DDBJ数据库中保存的PCSK9基因序列进行比对，根据比对获得的序列差异确定突变位点。
1.6 统计学处理采用SPSS 16.0软件行统计学分析。计量资料以x±s表示，不同组间临床指标比较采用t 检验或F检验；计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。使用单因素和多因素logistic回归分析PCSK9基因D320N突变与不同类型冠心病之间的关系。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 各种类型冠心病患者的性别和年龄分布将病例组患者分为心绞痛、心肌梗死、无症状性心肌缺血、缺血性心肌病、猝死5个亚组，心绞痛组男性1 182例（58.0%）、女性857例（42.0%）；心肌梗死组男性207例（59.8%）、女性139例（40.2%）；无症状性心肌缺血组男性362例（60.8%）、女性233例（39.2%）；缺血性心肌病组男性274例（62.1%）、女性167例（37.9%）；猝死组男性22例（75.9%）、女性7例（24.1%）。健康对照组男性657例（59.7%）、女性443例（40.3%）。各组间性别差异无统计学意义（χ2＝6.88，P＞0.05）。心绞痛组患者平均年龄为（49.3±8.3）岁、心肌梗死组（48.6±9.1）岁、无症状性心肌缺血组（50.3±9.7）岁、缺血性心肌病组（50.2±9.3）岁、猝死组（49.4±9.6）岁、健康对照组（49.7±10.2）岁，各组间年龄差异无统计学意义（F＝2.525，P＝0.058）。
2.2 各组血清血脂水平、PCSK9浓度与对照组相比，病例组患者血清PCSK9浓度及TC、TG、LDL-C水平均升高，冠心病家族史的患者比例和吸烟率也升高，HDL-C水平降低（P＜0.001）；而饮酒率两组差异无统计学意义（P＞0.05）。按无症状性心肌缺血组、心绞痛组、缺血性心肌病组、心肌梗死组及猝死组的顺序，各组患者血清PCSK9浓度及TC、TG、LDL-C水平，冠心病家族史患者比例及吸烟率逐渐升高，而HDL-C水平逐渐降低（P＜0.001）；饮酒率在各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。
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表 1 病例组和健康对照组血清血脂水平及PCSK9浓度的比较 Tab 1 Comparison of serum lipid levels and PCSK9 concentrations of subjects between case and control groups |
2.3 PCSK9基因第6外显子D320N位点多态性直接测序结果
PCR产物纯化后的双向测序结果显示，PCSK9基因D320N位点存在G和A两种等位基因，共有3种基因型：AA（突变纯合子）、GA（突变杂合子）、GG（野生型）。见图 1。
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图 1 PCSK9基因D320N位点多态性表达情况 Fig 1 D320N locus polymorphism in PCSK9 gene PCSK9: Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 |
2.4 不同类型冠心病亚组和健康对照组PCSK9基因D320N位点多态性的基因型和等位基因频率分布
病例组中AA、GA的基因型频率分别为3.6%、13.9%，分别高于对照组的1.1%、7.0%（χ2＝20.502，39.646；P＜0.001）；病例组中A等位基因的频率为10.5%，高于对照组的4.6%（χ2＝70.481，P＜0.001）。猝死组中AA、GA的基因型频率分别为17.2%、34.5%，A等位基因的频率为34.5%；心肌梗死组中AA、GA的基因型频率分别为9.0%、20.8%，A等位基因的频率为19.4%；缺血性心肌病组中分别为5.9%、16.8%和14.3%；心绞痛组中分别为2.9%、13.0%和9.4%；无症状性心肌缺血组中分别为2.4%、9.6%和7.1%。按无症状性心肌缺血组、心绞痛组、缺血性心肌病组、心肌梗死组及猝死组的顺序，AA、GA的基因型频率以及A等位基因的频率均逐渐升高，猝死组中最高，而无症状性心肌病组最低（P＜0.001）。见表 2。
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表 2 病例组与健康对照组PCSK9基因D320N位点多态性的基因型和等位基因频率 Tab 2 Frequencies of genotypes and alleles of D320N locus polymorphism in PCSK9 gene in case and control groups |
2.5 多因素logistic回归分析结果
以冠心病（无＝0，有＝1）为因变量，以性别（男＝1，女＝2）、年龄（＜40岁＝0，40~49岁＝1，50~59岁＝2，60~69岁＝3，≥70岁＝4）、TC水平、TG水平、LDL-C水平、HDL-C水平、PCSK9浓度、PCSK9基因D320N位点基因型（GG＝0，GA＝1，AA＝2）为自变量行logistic回归分析，结果显示PCSK9 基因D320N位点GA、AA基因型均为冠心病严重程度的独立危险因素（P均＜0.001），表明AA基因型和A等位基因与冠心病严重程度密切相关。见表 3。
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表 3 冠心病危险因素的logistic回归分析结果 Tab 3 Logistic regression analysis of risk factors for coronary heart disease |
3 讨论
冠心病的发生和进展中遗传因素发挥了重要作用，了解基因突变与冠心病的关系对冠心病的综合评价及预防治疗有重要意义。本研究发现，病例组患者的冠心病家族史比例高于对照组，证实遗传因素与冠心病的发生有关。研究表明，冠心病患者的血脂存在异常，其在冠心病的进展中发挥了重要作用[9-10]。本研究也发现病例组中患者的血清TC、TG、LDL-C水平均高于对照组，HDL-C水平低于对照组，表明血脂水平的异常对冠心病的发生、发展有促进作用。将病例组按不同类型分组后发现，按无症状性心肌缺血组、心绞痛组、缺血性心肌病组、心肌梗死组及猝死组的顺序，患者的血清TC、TG、LDL-C水平，冠心病家族史比例和吸烟率均逐渐升高，而HDL-C水平逐渐降低，其中猝死组最高，无症状心肌病组最低。表明随着病情加重血脂水平更容易出现异常，冠心病家族史的比例也逐渐增加，证实遗传因素与冠心病有关。
PCSK9与胆固醇代谢密切相关，能够通过调节低密度脂蛋白受体（LDLR）等的作用促进冠心病的进展[11-12]。本研究发现病例组患者血清PCSK9浓度高于对照组，与其他报道[13-14]相符。将病例组按不同类型分组后，PCSK9浓度在猝死组、心肌梗死组、缺血性心肌病组、心绞痛组、无症状性心肌缺血组中逐渐降低，表明PCSK9浓度可能对评估冠心病病情有一定帮助。
有研究发现PCSK9基因多态性与冠心病的发生有关[6-7, 15]，本课题组前期研究发现PCSK9基因的D320N突变是引起高胆固醇血症的原因之一[5]。高胆固醇血症是冠心病的重要危险因素，而该位点与冠心病发病是否有关尚未见报道。PCSK9基因位于染色体1p33~p34.4，全长3 617个碱基，编码12个外显子，D320N位点位于PCSK9基因编码蛋白的催化域，该位点发生突变会直接影响PCSK9的催化功能。本研究显示，病例组中AA、GA的基因型频率均高于对照组，A等位基因的频率也高于对照组。将病例组按不同类型分组后，猝死组中AA、GA的基因型频率和A等位基因频率最高，其次为心肌梗死组和缺血性心肌病组、心绞痛组，无症状性心肌缺血组最低，表明PCSK9基因突变可能与冠心病病情的严重程度有关。多因素logistic回归分析显示，GA、AA基因型与冠心病的发生和发展密切相关，是冠心病的独立危险因素。
综上所述，PCSK9 基因D320N位点突变与冠心病的发生、发展密切相关，是冠心病发生的重要危险因素，但具体机制还有待大规模、多中心研究予以证实。
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