肝癌是世界排名第2位的癌症相关致死原因，在发展中国家尤为突出。近些年肝癌发病率在发达国家中越来越高，主要原因是丙型肝炎病毒感染、酗酒、肥胖和代谢综合征相关的非酒精性脂肪肝等^[1]。因此，防治肝癌的研究显得刻不容缓。

目前肝癌的治疗手段主要包括手术、肝移植、肝动脉栓塞化学治疗和全身系统性治疗等^[2]。小分子多激酶抑制剂索拉非尼是第1个也是唯一适用于不适合手术的晚期肝癌患者的全身系统治疗药物^[3]。索拉非尼可以抑制肿瘤细胞的增殖和肿瘤血管生成^[4-5]。在2项晚期肝癌患者的随机Ⅲ期临床试验中，索拉非尼改善疾病进展和延长的总生存期分别为2.8个月和2.3个月。这表明索拉非尼延长肝癌患者生存时间的作用十分有限，目前认为其主要原因是继发性耐药^[6]。研究表明，肝癌细胞中索拉非尼耐药与PI3K/Akt信号通路、自噬、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肿瘤微环境和表观遗传调控等有关^[7]。然而，肝癌细胞索拉非尼耐药机制仍需要进一步的研究。

程序性死亡配体1（programmed cell death ligand-1，PD-L1）是B7分子家族中一个重要的成员，可以与T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞和自然杀伤T淋巴细胞上表达的程序性死亡1（programmed death-1，PD-1）结合后抑制肿瘤免疫^[8]。多项研究显示，PD-L1在耐药肿瘤细胞中高表达，如恩杂鲁胺耐药的前列腺癌^[9]、顺铂耐药的小细胞肺癌^[10]和厄洛替尼耐药的非小细胞肺癌^[11]，这表明PD-L1参与多种肿瘤细胞的耐药机制。

本研究旨在探讨PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中的表达及其功能。首先成功建立索拉非尼耐药的人肝癌细胞株，并采用qPCR和蛋白质印迹法检测耐药基因和PD-L1的表达。转染siRNA沉默索拉非尼耐药肝癌细胞中PD-L1的表达，研究其在细胞增殖、迁移、克隆形成和凋亡中的作用。

人肝癌细胞系Hep3B、HepG2（中国科学院细胞库）；索拉非尼（sorafenib，美国Selleck公司）；DMEM培养液、0.25%胰酶（含EDTA）、青霉素-链霉素混合液（penicillin-streptomycin liquid，双抗；美国HyClone公司）；TRIzol、PrimeScript^® RT Reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKaRa公司）；探针（universal Probe Library Set）、Master mix（瑞士Roche公司）；P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）基因多药耐药1（multidrug resistance 1，MDR1）引物、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein 1，MRP1）引物、PD-L1引物、GAPDH引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]；Lipofectamine^TM 2000（美国Invitrogen公司）；PD-L1 siRNA、Control siRNA（上海吉玛制药技术有限公司）；蛋白marker、BCA蛋白定量液（美国Thermo公司）；牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA；美国MP公司）；兔抗人PD-L1一抗、兔抗人P-gp一抗、兔抗人MRP1一抗、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（英国Abcam公司）；鼠抗人GAPDH一抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；Annexin Ⅴ-APC，PI凋亡检测试剂盒（美国Biolegend公司）；ECM550试剂盒、PDVF膜、ECL发光液（美国Millipore公司）；CCK-8溶液（日本Dojindo公司）。

Hep3B、HepG2细胞于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素和链霉素各100 U/L的DMEM培养液中培养，在37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育，待细胞融合度达80%~90%消化传代。取对数生长期细胞进行实验。

取对数生长期细胞以4 000/孔的密度接种于96孔板。实验组设不同浓度的索拉非尼（1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L），每个浓度设3个复孔，另设不加索拉非尼的对照组和不含细胞的空白组。药物作用24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8试剂，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中孵育4 h，使用酶标仪检测450 nm波长处光密度（D）值，计算IC₅₀。

采用药物持续接触浓度递增法诱导索拉非尼耐药细胞株。选取对数生长期细胞，以Hep3B、HepG2细胞各自的IC₅₀药物浓度为起始诱导浓度，并以0.25 μmol/L的浓度递增，历时6个月，获得索拉非尼耐药的Hep3B-SR、HepG2-SR细胞。

按照1.3项下的方法，计算耐药细胞Hep3B-SR和HepG2-SR的IC₅₀值。耐药指数＝耐药细胞IC₅₀/亲本细胞IC₅₀。

取对数生长期的细胞，用PBS洗3次并吸干残留液体，加入1 mL TRIzol提取总RNA并定量，去DNA反应后反转录成cDNA，用荧光定量PCR仪-CFX96进行qPCR。10 μL反应体系：Master mix 5 μL、引物0.3 μL、探针0.15 μL、cDNA模板2.5 μL、灭菌蒸馏水2.05 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，45个循环；40 ℃ 30 s，1个循环。PD-L1上游引物5' -TGG ATC CAG TCA CCT CTG AAT-3' ，下游引物5' -TGC TTG TCC AGA TGA CTT CG-3' 。MDR1上游引物5' -GGA GGA AGA CAT GAC CAG GTA-3' ，下游引物5' -CAC CAA TTC CAC TGT AAT AAT AGG C-3' 。MRP1上游引物5' -CTG GTG CCC TGA GAC AGA C-3' ，下游引物5' -ACC AGG AAA CCA CTT GCA TT-3' 。内参基因GAPDH上游引物5' -TCC ACT GGC GTC TTC ACC-3' ，下游引物5' -GGC AGA GAT GAT GAC CCT TTT-3' 。

取对数生长期细胞，用PBS洗3次并吸干残留液体，加入适量的蛋白裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白样品进行定量，蛋白样品与5×上样缓冲液混合后，97 ℃加热5 min使蛋白变性。每条泳道蛋白上样20 μL，90 V恒压电泳20 min，110 V恒压电泳70 min，200 mA恒流转膜60 min。BSA常温封闭3 h，加P-gp、MRP1、PD-L1和GAPDH一抗4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗后加二抗室温摇床孵育2 h，清洗曝光、拍照。

取对数生长期耐药细胞进行siRNA转染。PD-L1 siRNA序列为5' -GCC GAA GUC AUC UGG ACA ATT UUG UCC AGA UGA CUU CGG CTT-3' 。Control siRNA序列为5' -UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3' 和5' -ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3' 。根据说明书方法，将PD-L1 siRNA和Control siRNA转染进细胞，48 h后提取样品，通过qPCR和蛋白质印迹法检测沉默效率。

将耐药细胞分为PD-L1 siRNA组和Control siRNA组，接种于96孔板，设3个复孔，分别培养24、48、72、96 h。在培养结束前4 h每孔加入CCK-8试剂10 μL，用酶标仪测定450 nm处D值。得到的D值与初始值比较，增加或降低反映细胞生长或死亡。

实验设置5组：DMSO组、索拉非尼组、Control siRNA组、PD-L1 siRNA组、索拉非尼+PD-L1 siRNA组。划痕实验采用对数生长期耐药细胞接种于6孔板，使用200 μL枪头进行划痕，用PBS洗2次，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，分别于0、24 h拍摄照片；对比0、24 h时的划痕宽度以反映细胞的迁移能力。平板克隆形成实验采用对数生长期耐药细胞接种于6孔板，每孔200个细胞，在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养14 d，经过4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫溶液染色，计算克隆形成率。克隆形成率（%）＝克隆数/接种数×100%。流式细胞术检测细胞凋亡，采用对数生长期耐药细胞接种于6孔板进行实验，细胞密度为1×10⁵/孔，24 h后按照说明书方法进行操作，使用C6式流式检测系统进行检测。

本研究所有IC₅₀和图表均采用Graphpad Prism 5.0软件进行计算和制作。所有实验均重复3次，实验数据表示为x±s，使用SPSS 14.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。检验水准（α）为0.05。

Hep3B细胞的IC₅₀为（2.88±0.07）μmol/L，低于Hep3B-SR细胞的（15.51±0.26）μmol/L（t＝46.79，P＜0.01）；HepG2细胞的IC₅₀为（2.98±0.05）μmol/L，低于HepG2-SR细胞的（15.58±0.13）μmol/L（t＝89.32，P＜0.01）。Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的耐药指数分别为5.4和5.2。如图 1所示，蛋白质印迹结果显示Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中P-gp和MRP1表达均高于其亲本细胞。qPCR结果检测结果示Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中MDR1表达均高于其亲本细胞（6.53±0.38 vs 1.00±0.08，11.95±0.69 vs 1.00±0.02，t＝14.21、15.91，P均＜0.01），MRP1表达也均高于其亲本细胞（8.77±0.40 vs 1.00±0.07，6.99±0.66 vs 1.00±0.16，t＝19.24、8.80，P均＜0.01）。以上结果表明成功建立索拉非尼耐药人肝癌细胞株。

图 1 蛋白质印迹法检测索拉非尼耐药人肝癌细胞耐药性 Fig 1 Drug resistance of sorafenib-resistant human hepatocellular carcinoma cells by Western blotting P-gp: P-glycoprotein; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; MRP1: Multidrug resistance-associated protein 1

为明确PD-L1在亲本细胞和耐药细胞中的表达差异，Hep3B、Hep3B-SR、HepG2和HepG2-SR 4种细胞分别被设置为2组，即对照组（DMSO）和实验组（给予索拉非尼10 μmol/L）。如图 2所示，蛋白质印迹结果显示耐药细胞实验组PD-L1表达与对照组比较无明显差异，耐药细胞实验组和对照组PD-L1的表达均高于其亲本细胞，亲本细胞实验组PD-L1表达较对照组上调。qPCR从mRNA水平验证蛋白质印迹结果，以上差异均有统计学意义（P均＜0.01）。以上结果表明PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中高表达。

图 2 索拉非尼耐药人肝癌细胞PD-L1表达上调 Fig 2 Upregulated expression of PD-L1 in sorafenib-resistant human hepatocellular carcinoma cells Expression of PD-L1 examined by Western blotting and qPCR. DMSO: Dimethyl sulphoxide; Sor: Sorafenib (10 μmol/L); PD-L1:Programmed cell death ligand-1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.**P < 0.01. n＝3, x±s

为进一步验证PD-L1与人肝癌细胞索拉非尼耐药的相关性，转染PD-L1 siRNA沉默PD-L1表达，以转染Control siRNA作为对照。PD-L1 siRNA组Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中PD-L1 mRNA表达均较Control siRNA组下调（1.00±0.09 vs 4.01±0.12，1.00±0.10 vs 3.58±0.25，t＝20.24、9.63，P均＜0.01），2种耐药细胞沉默效率分别为80%和78%。蛋白表达也证明耐药细胞中PD-L1被成功沉默（图 3A）。

图 3 沉默PD-L1表达后部分逆转索拉非尼耐药肝癌细胞的耐药性 Fig 3 Silencing PD-L1 expression can partly reverse the drug resistance of hepatocellular carcinoma cells A: Western blotting; B, C: CCK-8 assay. Ctrl: Control; PD-L1: Programmed cell death ligand-1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; P-gp: P-glycoprotein; MRP1: Multidrug resistance-associated protein 1; IC50: Half inhibition concentration. **P < 0.01. n＝3, x±s

如图 3B、3C所示，耐药细胞PD-L1 siRNA组IC₅₀较Control siRNA组低（P＜0.01）。Control siRNA组Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的耐药指数分别为5.4和5.3。PD-L1 siRNA组Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的耐药指数分别下降为1.8和1.5，说明沉默PD-L1表达后耐药细胞的耐药性下降。

如图 3A所示，在Hep3B-SR和HepG2-SR细胞中，PD-L1 siRNA组P-gp的表达均较Control siRNA组下调（1.00±0.05 vs 7.36±0.51，1.00±0.06 vs 3.54±0.09，t＝12.48、23.34，P均＜0.01），MRP1表达也均较Control siRNA组下调（1.00±0.07 vs 2.24±0.19，1.00±0.07 vs 4.42±0.64，t＝6.06、5.29，P均＜0.01）。蛋白质印迹法和qPCR结果表明沉默PD-L1后P-gp和MRP1的表达均下调。以上结果证明沉默PD-L1部分逆转索拉非尼耐药人肝癌细胞的耐药性。

如图 4A、4B所示，CCK-8法检测发现PD-L1 siRNA组Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的增殖能力在24、48、72、96 h时均低于Control siRNA组（P均＜0.01），表明沉默PD-L1表达后细胞增殖能力下降。

图 4 沉默PD-L1表达可抑制索拉非尼耐药人肝癌细胞的增殖、迁移和克隆形成并促进其凋亡 Fig 4 Silencing PD-L1 expression can repress the proliferation, migration and cloning formation of sorafenib-resistant human hepatocellular carcinoma cell and promote its apoptosis A, B: Cell proliferation by CCK-8 assay; C, D: Cell migration by wound healing assay; E, F: Cell cloning formation by colony formation assay; G, H: Cell apoptosis by flow cytometry. A, C, E, G: Hep3B-SR; B, D, F, H: HepG2-SR. Ctrl: Control; PD-L1: Programmed cell death ligand-1; DMSO: Dimethyl sulphoxide. **P < 0.01. n＝3, x±s

如图 4C、4D所示，划痕实验结果示Hep3B-SR和HepG2-SR细胞迁移宽度/划痕宽度为Control siRNA组＞PD-L1 siRNA组＞索拉非尼+PD-L1 siRNA组（F＝299.2、78.8，P均＜0.01），表明抑制PD-L1表达后耐药细胞迁移能力下降。

如图 4E、4F所示，Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的克隆形成率为Control siRNA组＞PD-L1 siRNA组＞索拉非尼+PD-L1 siRNA组（F＝155.8、283.2，P均＜0.01），表明沉默PD-L1表达后耐药细胞克隆形成率下降。

如图 4G、4H所示，Hep3B-SR和HepG2-SR细胞的凋亡比例为Control siRNA组＜PD-L1 siRNA组＜索拉非尼+PD-L1 siRNA组（F＝202.8、164.2，P均＜0.01），表明沉默PD-L1表达后耐药细胞凋亡增加。

肝癌目前在全球范围内仍然是导致人类死亡的主要疾病之一^[12]。多激酶抑制剂索拉非尼是唯一适用于晚期肝癌患者的全身化学治疗药物，然而大部分患者在用药几个月后便出现耐药现象。研究表明肝癌中发生索拉非尼耐药是一个包含多种机制的复杂过程，介导肿瘤免疫逃逸的PD-L1参与多种肿瘤细胞的耐药过程^[2]。

本课题组前期进行了浓度梯度实验（药物浓度分别为2.5、5、10、15、20 μmol/L），结果显示当索拉非尼浓度为10 μmol/L时肝癌细胞中PD-L1的表达上调且肝癌细胞的生长状态良好，因此结果2.2中实验组和功能实验中索拉非尼组剂量均为10 μmol/L。多药耐药已经被证明与ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）超家族的转运蛋白过表达有关，包括P-gp/ABCB1、MRP1/ABCC1等^[13]，因此选取耐药基因MDR1和MRP1作为耐药性检测的重要指标。

本研究首先建立索拉非尼耐药人肝癌细胞Hep3B-SR和HepG2-SR，利用qPCR和蛋白质印迹法证实耐药细胞PD-L1的表达较亲本细胞上调，表明PD-L1在索拉非尼耐药肝癌细胞中高表达。沉默耐药细胞中PD-L1表达后，PD-L1 siRNA组的IC₅₀较Control siRNA组下降，但仍高于其亲本细胞，并且耐药细胞PD-L1 siRNA组中P-gp和MRP1的表达较Control siRNA组下调，表明沉默PD-L1的表达可部分逆转肝癌细胞的索拉非尼耐药性。

通过功能实验发现，沉默PD-L1的表达可以有效抑制索拉非尼耐药人肝癌细胞的增殖、迁移、克隆形成和促进凋亡，尤其是合用索拉非尼时作用更为显著，表明PD-L1与索拉非尼耐药人肝癌细胞的生物功能学特性有关。

Liu等^[14]研究发现，PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中表达上调。本实验也观察到PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中高表达，并进一步证明沉默PD-L1表达后可逆转索拉非尼耐药人肝癌细胞的耐药性，并且可抑制其增殖、迁移、克隆形成并促进其凋亡。前文已述，PI3K/Akt通路参与肝癌细胞的索拉非尼耐药，索拉非尼耐药人肝癌细胞中Akt表达上调。此外，还有研究发现索拉非尼耐药人肝癌细胞中IL-6和STAT3表达上调^[7]，而PD-L1在多种耐药难治性肿瘤中的异常表达均与PI3K/Akt通路、STAT3通路和IL-6有关^[15-16]。因此，本课题组后期将进一步探讨索拉非尼耐药人肝癌细胞中PD-L1表达异常与PI3K/Akt通路、STAT3通路和IL-6的关系。

综上所述，PD-L1在索拉非尼耐药人肝癌细胞中表达上调，沉默PD-L1表达后可有效抑制耐药细胞的增殖、迁移、克隆形成和促进其凋亡，合用索拉非尼后其抗癌效果更显著。本实验证明了PD-L1是有效改善肝癌细胞索拉非尼耐药的一个新靶点，沉默PD-L1表达可有效抑制索拉非尼耐药肝癌细胞的生长，为进一步研究PD-L1参与肝癌细胞索拉非尼耐药的机制奠定了基础。