2018, Vol. 39
2. 佳木斯大学药学院生药学教研室, 佳木斯 154007;
3. 福建中医药大学药学院, 福州 350122
2. Department of Pharmacognosy, School of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China;
3. School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian, China
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨组织微结构退化以及易发生骨折为特征的老年疾病[1]。随着人类社会发展和人口老龄化加快，OP导致的老年人髋骨骨折的发生率逐年升高，严重威胁老年人的生命健康和生活质量[2]。OP的发生与雌激素缺失、衰老导致的氧化应激和生活方式紧密相关，并受多个代谢通路的调控[3]。
中药复方具有多成分和多靶点综合调节机体功能的特点，临床上用于防治OP取得了显著疗效，具有良好的应用前景[4]。二仙汤(Er-Xian Decoction)是张伯讷教授在20世纪50年代创制的著名方剂，由仙茅、淫羊藿、黄柏、巴戟天、当归和知母组成，具有温肾益精、滋阴降火的双重调节功能，临床上用于防治妇女更年期综合征和OP[5]。本课题组前期研究了二仙汤对去卵巢大鼠的抗骨质疏松作用，通过在成骨细胞和破骨细胞中的导向活性分离获得了二仙汤调控骨代谢的有效成分，并以其有效成分为指标富集制备了二仙汤抗骨质疏松的有效组分[6-7]。本实验通过观察二仙汤抗骨质疏松有效组分对维甲酸致骨质疏松模型大鼠的影响，明确其抗骨质疏松作用，为其临床应用和新药开发提供科学依据。
1 材料和方法 1.1 仪器、试剂与动物PL3001-S型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；W2-100SP型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；ELx800型连续波长酶标仪，美国Bio-Tek公司；eXplore Locus SP型显微CT仪，美国GE公司。
戊酸雌二醇片(estradiol valeratse，E2V；批号092A2)，拜耳医药保健有限公司广州分公司；维甲酸(批号20140902，纯度100.08%)，上海邦成化工有限公司；ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
3月龄SD雌性大鼠60只，体质量(250±10)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016。在温度(24.0±0.5)℃、湿度45%~50%、通风良好的清洁级实验室喂养，自由饮水及进食，适应性喂养7 d。
1.2 药物制备与配制 1.2.1 药物制备二仙汤处方6味中药饮片购于上海雷允上药业有限公司，并经张巧艳教授鉴定分别为中药淫羊藿、仙茅、知母、黄柏、巴戟天和当归。6味中药饮片按处方比例混匀，按每克药材加8 mL 50%乙醇提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，即为粗提液。提取液减压浓缩到相对密度为1.23 g/mL，过滤，滤液加蒸馏水稀释到相对密度为1.08 g/mL，即为待上柱纯化样品液。将样品液按1个树脂床体积倍数(BV)的上样量通入装有ZTC-1大孔树脂的色谱柱中，依次用水、50%乙醇和95%乙醇洗脱，收集50%乙醇洗脱部分，减压浓缩成相对密度为1.25 g/mL的浸膏，60 ℃干燥，粉碎，得棕黄色粉末，即为二仙汤抗骨质疏松有效组分。应用本课题组建立的HPLC含量测定方法分析主要有效成分的含量，结果表明二仙汤抗骨质疏松有效组分中各组分的百分浓度如下：仙茅苷0.87%，朝藿定B 3.91%，淫羊藿苷4.05%，新芒果苷8.22%，芒果苷3.62%，阿魏酸0.33%，盐酸巴马汀2.01%，盐酸小檗碱2.96%，水晶兰苷0.06%，去乙酰基车叶草苷酸0.08%，知母皂苷B Ⅱ 17.43%。
1.2.2 溶液配制精密称取维甲酸，用0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose，CMC-Na)混悬溶液配制成质量浓度为7.0 mg/mL的溶液。
精密称取二仙汤抗骨质疏松有效组分，用0.5% CMC-Na混悬溶液配制成质量浓度分别为5.0、10.0和20.0 mg/mL的溶液。
取E2V片，用0.5% CMC-Na混悬溶液配制成E2V质量浓度为0.02 mg/mL的溶液。
1.3 动物分组、造模与给药按体质量将60只SD大鼠随机分成6组，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组(E2V 0.2 mg/kg)和二仙汤抗骨质疏松有效组分低、中、高剂量组(50、100、200 mg/kg)，每组10只。除空白对照组外，其余各组大鼠每天按70 mg/kg灌胃给予维甲酸溶液，连续14 d，建立骨质疏松模型；空白对照组大鼠灌胃给予等量0.5% CMC-Na混悬溶液。从第15天开始，每天给予大鼠灌胃给药剂量为10 mL/kg，每天1次，连续28 d；空白对照组与模型组给予等量0.5% CMC-Na混悬溶液。每周称量大鼠体质量1次，并根据体质量调整给药剂量。
1.4 标本采集与检测 1.4.1 尿液生物化学指标处死前将各组大鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，收集大鼠的尿液，按照试剂盒说明书检测尿钙(calcium in urine，U-Ca)和尿肌酐(creatinine in urine，U-Crea)的水平。
1.4.2 血清生物化学指标用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉取血，以6 853.6×g离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书检测血清钙(calcium in serum，S-Ca)、血清磷(phosphatase in serum，S-P)的含量，以及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(osteocalcin，OCN)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)的活性。
1.4.3 骨密度及骨组织形态计量学取大鼠右侧后肢股骨用10%甲醛溶液固定2周后，剔除股骨上剩余的肌肉，用显微CT仪进行骨密度及骨组织形态计量学测定，并用Micview V2.1.2三维重建处理软件和ABA专用骨骼分析软件进行数据处理。
仪器设置参数如下：(1)扫描协议，001标本，即largetube_14 μm_120 min_ss；(2)扫描参数，扫描分辨率14 μm，旋转角度360°，旋转角度增量0.4°，电压80 kV，电流80 μA，曝光时间2 960 ms，帧平均数为4，像素组合为1×1；(3)图像参数，原始尺寸16.897 mm×13.442 mm×6.474 mm，分辨率29 μm，16位。
1.5 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行数据分析。实验结果以x±s表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 二仙汤抗骨质疏松有效组分对大鼠血清和尿液中钙、磷含量的影响如表 1所示，与空白对照组大鼠比较，模型组、二仙汤抗骨质疏松有效组分各剂量组和E2V组大鼠S-Ca含量均没有显著变化；模型组大鼠S-P含量降低(P＜0.01)，低剂量和高剂量二仙汤抗骨质疏松有效组分均可提高大鼠S-P含量(P＜0.05，P＜0.01)，E2V对大鼠S-P的含量没有显著影响；模型组大鼠U-Ca含量和U-Ca/U-Crea值升高(P均＜0.05)，各剂量二仙汤抗骨质疏松有效组分和E2V均可降低大鼠U-Ca含量和U-Ca/U-Crea值(P均＜0.05)，表明二仙汤抗骨质疏松有效组分可降低维甲酸致骨质疏松大鼠的骨丢失。
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表 1 各组大鼠血清和尿液中钙、磷的含量 Tab 1 Contents of calcium and phosphorus in serum and urine of rats in each group |
2.2 二仙汤抗骨质疏松有效组分对大鼠血清骨代谢生物化学指标的影响
如表 2所示，与空白对照组大鼠比较，模型组、二仙汤抗骨质疏松有效组分各剂量组和E2V组大鼠血清OCN活性没有显著变化；模型组大鼠血清ALP和TRAP活性升高(P＜0.05，P＜0.01)，各剂量二仙汤抗骨质疏松有效组分和E2V均可降低大鼠血清ALP和TRAP活性(P＜0.05，P＜0.01)，表明二仙汤抗骨质疏松有效组分可调控维甲酸致骨质疏松大鼠的骨代谢。
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表 2 各组大鼠血清骨代谢生物化学指标 Tab 2 Biochemical parameters related with bone metabolism in serum of rats in each group |
2.3 二仙汤抗骨质疏松有效组分对大鼠股骨骨密度和骨矿物质含量的影响
如表 3所示，与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠股骨的骨密度和骨矿物质含量降低(P＜0.01，P＜0.05)，二仙汤抗骨质疏松有效组分和E2V均可增加股骨的骨密度和骨矿物质含量，在高剂量时与模型组比较差异均有统计学意义(P均＜0.05)。
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表 3 各组大鼠股骨的骨密度和骨矿物质含量 Tab 3 Bone mineral density and bone mineral content in femur of rats in each group |
2.4 二仙汤抗骨质疏松有效组分对大鼠股骨骨组织形态计量学参数的影响
见图 1。与空白对照组大鼠比较，模型组大鼠皮质骨变薄，松质骨骨小梁稀疏，骨小梁间隙增加，骨丢失严重。二仙汤抗骨质疏松有效组分和E2V能够减缓维甲酸致骨质疏松大鼠的皮质骨减少，抑制大鼠骨小梁微结构的退化，降低骨小梁间隙，表明二仙汤抗骨质疏松有效组分可减轻维甲酸致骨质疏松大鼠骨组织微结构的退化。
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图 1 大鼠股骨横切面的显微CT 3D扫描图(A)和平面扫描图(B) Fig 1 3D scanning (A) and flat scanning (B) photos of femur cross-section of rats using micro-CT E2V: Estradiol valeratse; EXD-L: Er-Xian Decoction low-dose; EXD-M: Er-Xian Decoction middle-dose; EXD-H: Er-Xian Decoction high-dose |
如表 4所示，与空白对照组比较，模型组大鼠股骨的骨组织形态计量参数显著改变，骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N.)和骨小梁厚度(Tb.Th.)减少(P＜0.01，P＜0.05)，骨表面积与骨体积比值(BS/BV)和骨小梁分离度(Tb.Sp.)增加(P＜0.05，P＜0.01)。二仙汤抗骨质疏松有效组分和E2V均可增加维甲酸致骨质疏松大鼠股骨BV/TV、Tb.N.和Tb.Th.，降低BS/BV和Tb.Sp.，并且在高剂量时对BV/TV、Tb.N.、Tb.Sp.的改善作用与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，表明二仙汤抗骨质疏松有效组分可减少维甲酸致骨质疏松大鼠的骨丢失，改善骨组织的微结构。
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表 4 各组大鼠股骨骨组织形态计量学参数 Tab 4 Histomorphometric parameters of femur in rats in each group |
3 讨论
中医认为OP属于“骨痿”“骨痹”或“腰背痛”的范畴，其病因在于肾精亏虚，故常用补肾填精的方法进行治疗[8]。二仙汤由温补肾阳的淫羊藿和仙茅等组成，具有雌激素样作用[9]，可不同程度地延缓下丘脑-垂体-性腺轴的衰老，增加去卵巢骨质疏松大鼠股骨的骨密度、胫骨的骨小梁面积百分比和Tb.Th.，减少Tb.Sp.[10]。本课题组以成骨细胞和破骨细胞为模型筛选获得了二仙汤抗骨质疏松的多种有效成分，并富集制备得到了有效组分[7]。本实验观察了二仙汤抗骨质疏松有效组分对维甲酸致骨质疏松大鼠的作用，结果显示二仙汤抗骨质疏松有效组分可降低维甲酸致骨质疏松大鼠的骨丢失。
维甲酸是维生素A的合成衍生物，临床常用于治疗皮肤病和白血病，长期应用可导致骨代谢紊乱，引起骨质破坏和OP[11]。给予3月龄大鼠70 mg/kg维甲酸2周可导致大鼠骨量减少，诱发OP[12]。有文献报道，大鼠口服维甲酸可造成性腺损伤，使体内雌激素水平下降，骨形成和骨吸收均增加，骨吸收大于骨形成，导致骨丢失和OP的发生[13]。因此，维甲酸和雌激素水平下降引起的OP均为高转换型OP，可以通过补充雌激素治疗。
不同研究者发现维甲酸引起骨代谢紊乱的特点不尽一致。吴波等[14]报道维甲酸对类骨质形成和骨基质钙化无明显影响，主要是增强破骨细胞的活性与功能，促进骨吸收。Hotchkiss等[15]则发现维甲酸可增加骨形成指标血清ALP的活性和骨吸收指标血清TRAP的活性，但他们分析认为血清ALP活性升高可能与维甲酸引起肝功能损伤有关，维甲酸对骨质的破坏作用主要是增加了破骨细胞的骨吸收作用。本实验也发现，维甲酸可升高大鼠血清ALP和TRAP的活性，这与文献报道[15]的结果一致，表明维甲酸引起的OP也属于高转换型OP。二仙汤抗骨质疏松有效组分可降低维甲酸致骨质疏松大鼠血清TRAP和ALP的活性，表明二仙汤可通过抑制骨的高转换减缓维甲酸致骨质疏松大鼠的骨丢失。
维甲酸诱导大鼠骨质疏松的过程中，破骨细胞的骨吸收活性增加，骨基质降解，骨基质中的钙随着尿液排出体外，U-Ca含量和U-Ca/U-Crea值升高[16]。二仙汤抗骨质疏松有效组分可降低维甲酸骨质疏松大鼠U-Ca含量和U-Ca/U-Crea值，表明二仙汤抗骨质疏松有效组分可抑制维甲酸致骨质疏松大鼠的骨吸收、减少骨丢失。
显微CT是一种可全面精确测量骨密度和骨组织微结构参数的新型技术，常用于OP和骨关节病的研究及药物抗骨质疏松作用的评价[17]。应用显微CT技术不仅可测定骨组织的骨密度和骨矿物质含量，还可精确测量骨组织形态计量学参数的变化，特别是松质骨中Tb.N.、Tb.Th.和Tb.Sp.等[18]。本实验结果表明，维甲酸可使大鼠的骨密度和骨矿物质含量减少，Tb.Th.降低，骨小梁之间的髓腔宽度增加，二仙汤抗骨质疏松有效组分能够增加骨密度和骨矿物质含量，改善骨质疏松骨的三维结构和骨小梁微结构的退化，增加Tb.N.，降低Tb.Sp.，其机制可能是二仙汤抗骨质疏松有效组分通过抑制维甲酸导致的骨高转换，减少骨丢失。这些结果可为二仙汤临床用于防治OP及其新药研究开发提供科学依据。
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