2018, Vol. 39
2. 扬州大学附属医院儿科, 扬州 225001
2. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu, China
Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9）可以识别细菌和病毒DNA中的非甲基化CpG基序，在机体清除细菌和病毒的防御机制中发挥重要作用，但过度的TLR9应答会对机体造成损害[1-2]。TLR9与系统性红斑狼疮（system lupus erythmatosis，SLE）等自身免疫病的发生和发展密切相关[3]，如SLE患者外周血中B淋巴细胞表达高水平的TLR9且与血清中抗双链DNA抗体水平呈正相关[4]；特异性阻断狼疮小鼠模型中TLR9的表达，导致血清中抗双链DNA抗体和抗Sm抗体的水平均降低[5]。因此，负向调节B淋巴细胞上的TLR9信号可能为自身免疫性疾病的治疗提供新思路。
Fcγ段受体（Fcγ receptor，FcγR）Ⅱb是免疫球蛋白（immune globulin，Ig）G的FcγR中唯一的抑制性受体[6]。免疫复合物（immune complex，IC）与B淋巴细胞表面的FcγRⅡb交联可以抑制B淋巴细胞活化及产生抗体[7]。我们前期研究发现，IC还能够通过FcγRⅡb抑制TLR9介导的免疫应答，如体外实验发现IC通过FcγRⅡb抑制B淋巴细胞TLR9配体CpG寡脱氧核苷酸（oligodeoxynucleotide，ODN）刺激的CD40和CD80高表达[8]。本研究进一步探讨IC对TLR9的这一负向调节作用在体内实验中是否同样存在，以及IC通过抑制哪些TLR9信号通路从而抑制CD40和CD80的表达。
1 材料和方法 1.1 材料与试剂C57BL/6小鼠购自扬州大学实验动物中心；背景品系为C57BL/6的FcγRⅡb缺陷小鼠购自美国杰克逊实验室，由扬州大学医学院转化医学研究院保种[实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0029]。CpG ODN由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列：5' -TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3' ，序列全部硫代化，经去内毒素纯化后使用；抗小鼠CD19磁珠购自美国美天旎生物技术有限公司；抗CD19、抗CD40和抗CD80的荧光标记抗体均购自美国Biolegend公司；细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）抑制剂PD98059、c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kainse，JNK）抑制剂SP600125和p38抑制剂SB203580均购自上海碧云天生物技术有限公司（货号分别为S1805、S1876、S1863）；兔抗p-JNK单克隆抗体、兔抗p-ERK单克隆抗体、兔抗p-p38单克隆抗体和兔抗β-actin单克隆抗体均购自美国Cell Signaling公司（货号分别为4671、4370、4511、4970）。
1.2 IC的制备参照文献[8]方法进行，简述如下：IC由卵清蛋白（ovalbumin，OVA）抗原与抗OVA按1:10的质量比混合，37 ℃孵育1 h后形成。体外刺激B淋巴细胞的IC为10 μg/mL OVA抗原和100 μg/mL抗OVA混合形成；体内实验中每只小鼠的IC为100 μg OVA抗原和1 mg抗OVA混合形成。
1.3 IC和CpG ODN体内注射小鼠腹腔注射IC 24 h后腹腔注射10 μg CpG ODN，注射CpG ODN 24 h后取小鼠脾脏，用免疫磁珠法分选获得脾脏CD19+ B淋巴细胞[9]，并检测其表面CD40和CD80的表达。
1.4 脾脏B淋巴细胞的分选于无菌条件下取小鼠脾脏，研磨后收集单细胞悬液，用Tris-NH4Cl溶液裂解红细胞，PBS洗涤1次，用抗CD19磁珠分选后，流式细胞术测定CD19+ B淋巴细胞纯度为95%左右。
1.5 流式细胞术检测B淋巴细胞表面CD40和CD80表达待检细胞中加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）-抗CD19和藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE）-抗CD40或PE-抗CD80，抗体的终浓度均为1 μg/mL，于4 ℃中放置20 min后用PBS洗涤，重悬于300 μL PBS中，上机检测并分析。
1.6 蛋白质印迹法检测蛋白磷酸化将B淋巴细胞按2×106/mL的密度铺入细胞培养板，用IC和（或）CpG ODN（终浓度0.3 μmol/L）处理30 min，用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，后转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，加入p-JNK、p-ERK、p-p38和β-actin一抗稀释液（稀释比例均为1:1 000），4 ℃静置孵育过夜，PBST洗涤后加入相应二抗，室温孵育2 h，PBST洗涤后用增强化学发光法显色。
1.7 抑制剂处理细胞将B淋巴细胞按2×105/孔的密度铺至96孔板，分别加入10 μmol/L PD98059、50 μmol/L SP600125和20 mg/L SB203580，同时设加DMSO作为对照组，处理细胞1 h后，再用0.3 μmol/L CpG ODN刺激细胞24 h，收集细胞用流式细胞术检测其表面CD40和CD80的表达情况。
1.8 统计学处理采用SPSS 12.0软件对数据进行录入和处理，正态分布且方差齐性的计量资料以x±s表示，组间两两比较采用t检验。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 IC抑制CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达结果如图 1所示，体内注射CpG ODN能够上调B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达（P均＜0.05），IC预处理可抑制CpG ODN活化的B淋巴细胞表面CD40和CD80表达上调（P均＜0.05）。
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图 1 IC体内抑制CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80表达上调 Fig 1 IC inhibits the up-regulated CD40 and CD80 expressions on CpG ODN-activated B lymphocytes in vivo IC: Immune complex; ODN: Oligodeoxynucleotide; MFI: Median fluorescent intensity. *P < 0.05. n=3, x±s |
2.2 IC抑制CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38的磷酸化
CpG ODN活化B淋巴细胞后不能明显诱导ERK磷酸化，但可以诱导JNK和p38磷酸化。而IC能够抑制CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38磷酸化（图 2）。
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图 2 IC抑制CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38磷酸化 Fig 2 IC inhibits JNK and p38 phosphorylation in CpG ODN-activated B lymphocytes IC: Immune complex; ODN: Oligodeoxynucleotide |
2.3 IC通过FcγRⅡb抑制CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38磷酸化
结果如图 3所示，IC对FcγRⅡb缺陷小鼠来源的CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38磷酸化水平无明显抑制作用，提示IC抑制CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38的磷酸化依赖于FcγRⅡb。
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图 3 IC对FcγRⅡb缺陷小鼠来源CpG ODN活化B淋巴细胞JNK和p38磷酸化的作用 Fig 3 Effects of IC on JNK and p38 phosphorylation in CpG ODN-activated B lymphocytes from FcγRⅡb-/- mice IC: Immune complex; ODN: Oligodeoxynucleotide; FcγRⅡb: Fcγ receptor Ⅱb |
2.4 JNK和p38抑制剂下调CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达
结果如图 4所示，JNK抑制剂（SP600125）和p38抑制剂（SB203580）均下调CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达（P均＜0.01），提示B淋巴细胞内CpG ODN通过JNK和p38通路调控CD40和CD80的表达。而ERK抑制剂（PD98059）未见相同作用。
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图 4 JNK和p38对CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80表达的影响 Fig 4 Effects of JNK and p38 on CD40 and CD80 expressions in CpG ODN-activated B lymphocytes A: Flow cytometry results; B: Quantitative analysis. PD98059: ERK inhibitor, 10 μmol/L; SP600125: JNK inhibitor, 50 μmol/L; SB203580: p38 inhibitor, 20 mg/L. ODN: Oligodeoxynucleotide; DMSO: Dimethyl sulphoxide; MFI: Median fluorescent intensity. **P < 0.01. n=3, x±s |
3 讨论
静脉注射IgG治疗多种自身免疫性疾病已取得良好的疗效[10]，IgG与可溶性抗原形成可溶性IC后能模拟静脉注射IgG的效应用于治疗某些自身免疫性疾病[11]。静脉注射Ig能负向调节树突状细胞表面CD80和CD86表达[12]，体外用IC可以抑制CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80表达上调[8]。本研究结果显示，体内注射IC同样能抑制CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80表达。有文献报道，B淋巴细胞和T淋巴细胞表面CD40与CD40配体（CD40L）相互作用对SLE自身抗体的产生有重要作用[13]，抗CD40L能阻断SLE小鼠自身抗体的产生[14]，提示阻断CD40-CD40L通路可能对治疗SLE有重要作用。
所有B淋巴细胞亚群均表达TLR9且能被TLR9配体活化[15]。TLR9不仅能被病毒和细菌DNA非甲基化CpG基序活化，同样也能被人工合成短的单链ODN活化[16]。因而，无论来源如何，所有富含CpG基序均能活化B淋巴细胞。B淋巴细胞TLR9介导的信号通路与树突状细胞类似，即TLR9配体作用于TLR9后引起丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB途径活化[17]。本实验发现，CpG ODN活化B淋巴细胞后引起NF-κB途径（数据未显示）以及JNK和p38-MAPK途径的活化，但不能明显诱导ERK-MAPK途径的活化；IC作用后CpG ODN诱导的NF-κB活化并没有受到明显影响（数据未显示），而JNK和p38的活化被明显抑制，提示IC并不是通过抑制NF-κB通路抑制CD40和CD80的表达，而有可能通过抑制JNK和p38-MAPK途径从而对CD40和CD80的表达发挥抑制作用。本实验结果表明，JNK和p38抑制剂能下调CpG ODN活化B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达，提示JNK和p38-MAPK途径确实参与了对CD40和CD80表达的调控。
IC抑制TLR9通路的机制目前还不清楚。前期检测了IC刺激后的B淋巴细胞内某些蛋白激酶的磷酸化水平，发现IC刺激不引起脾酪氨酸激酶和Bruton酪氨酸激酶的活化，但能使酪氨酸激酶Lyn活化。抑制Lyn会导致TLR4介导的CD40表达进一步增加，提示IC通过活化Lyn抑制TLR4介导的CD40高表达[18]。有文献报道，Lyn可以磷酸化接头蛋白Dok，维持含SH2区域肌醇5'磷酸酶1的活化，从而抑制NF-κB通路的活化[19-20]。此外，前期研究还发现激活B淋巴细胞Lyn可以抑制NF-κB通路的活化[21]。那么IC能否通过活化Lyn抑制TLR9通路中的JNK和p38-MAPK信号通路，从而抑制CD40和CD80的表达，仍需要进一步的实验研究。
综上所述，本研究发现IC与B淋巴细胞的FcγRⅡb结合抑制TLR9激动剂CpG ODN诱导的JNK和p38-MAPK途径，从而抑制B淋巴细胞表面CD40和CD80的表达。本实验结果有助于更全面地认识IC对TLR介导的免疫应答负向调节机制，也为治疗B淋巴细胞内过度TLR9应答提供了线索。
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