人腺病毒（human adenovirus，HAdV）属于腺病毒科（Adenoviridae）的哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）。根据不同的免疫学、生物学和生物化学特性可将其分为7个亚群（A~G），至今国际病毒分类委员会已经公布了57种血清型^[1]。引起部队呼吸道疫情的主要是B亚群HAdV感染，包括B1亚群的3型、7型和14型及B2亚群的55型。其中55型是基于HAdV-B14型基因组骨架嵌合HAdV-B11型Hexon基因部分片段的重组新病毒，近年来在我国已引起多起疫情^[2-4]。2016年，我军西南地区部队暴发多起HAdV感染的疫情，所引起的呼吸道感染在营区传播，严重影响部队日常训练等^[5-7]。

目前，HAdV感染和其他病毒性感染疾病一样，没有特效药物及疗效显著的治疗方法，主要依靠机体自身免疫系统的抵抗。机体产生的HAdV抗体对同型HAdV具有长久、稳定的保护性。因此，为进一步调查西南地区部队官兵体内HAdV55中和抗体状况，本研究收集了来成都军区总医院体检和就诊的官兵血清，筛查HAdV55抗体流行情况，并检测HAdV55抗体的中和活性，为部队预防和控制HAdV55疫情提供支持。

收集2016年于成都军区总医院就诊和体检的西南地区部队官兵中非呼吸道疾病患者的血清样本，血清分装后于－20 ℃冻存，共325份，其中男性279份、女性46份，患者平均年龄为（25.26±6.12）岁。

人喉癌上皮细胞系Hep-2由中国科学院细胞库提供，本实验室保存培养。Hep-2细胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培养液，于37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱中培养。HAdV55毒株由本课题组前期分离培养鉴定^[8]。

胎牛血清、DMEM培养液、青/链霉素、Invitrogen PureLink^TM Viral RNA/DNA Mini Kit均购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Millipore超滤管购自默克化工技术（上海）有限公司；常规ELISA试剂购自武汉基因美生物科技有限公司；HRP-羊抗人IgG、生物化学试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

将HAdV55病毒以Millipore超滤管（截留相对分子质量30 000）浓缩，浓缩液用包被液1:5稀释后包被ELISA板，4 ℃过夜。弃包被液，每孔加5%脱脂奶粉封闭液100 μL，37 ℃孵育2 h，洗板1次；将待测血清用包被液以1:1 000稀释，每孔加稀释后的血清100 μL，37 ℃孵育1 h，取出酶标板，洗板3次，每次5 min；每孔加酶标二抗（HRP-羊抗人IgG，1:5 000稀释）100 μL，37 ℃孵育30 min，用洗涤液洗板3次，每次5 min；加底物显色15 min终止反应，用酶标仪检测450 nm和630 nm波长处的光密度（D）值。

取细胞以1×10⁴/孔的密度接种至96孔板，按照常规方法培养过夜。将HAdV55病毒按10^－1~10^－9梯度稀释，每个稀释度设8孔，每孔加入100 μL病毒液。持续培养3 d后观察细胞病变，按照Reed-Muench公式计算病毒滴度。

按照1.4项下的方法将Hep-2细胞铺板，培养过夜。将阳性血清样本先用PBS等比稀释，过滤除菌，56 ℃灭活30 min。每份血清再按照原液、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32稀释后直接加入细胞板，培养3 d后观察细胞生长状态。

按照1.4项下方法将Hep-2细胞铺板，培养过夜。分别取ELISA检测结果为阳性的血清样本，先用PBS等比稀释，过滤除菌，56 ℃灭活30 min。每份血清再按照原液、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32稀释，与100倍半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose，TCID₅₀）HAdV55病毒等体积混匀，37 ℃孵育2 h，接入96孔板，每份标本感染3个孔，同时设病毒对照和细胞对照组，37 ℃、5% CO₂条件下静置培养，病毒对照呈现70%以上病变时判断结果。

采用SPSS 15.0软件进行数据分析。计数资料以例数和百分数表示，组间比较采用χ²检验。检验水准（α）为0.05。

抗体阳性率采用ELISA检测，以标准血清为阴性对照，抗体阳性判断标准为D₄₅₀/D₆₃₀≥2倍阴性对照值。325份血清样本中，共检出HAdV55抗体阳性19份，总体阳性率为5.85%；其中男性阳性率为5.37%（15/279），女性阳性率为8.70%（4/46），男女间HAdV55抗体阳性率差异无统计学意义（χ²＝0.790，P＝0.374）。

采用Reed-Muench法得到HAdV55分离株的TCID₅₀为2.5×10⁵，将病毒稀释至200倍TCID₅₀/100 μL备用。血清毒性实验结果显示，19份阳性血清中有11份在1:2稀释浓度时细胞出现细胞病变效应（cytopathic effects，CPE），2份血清在1:4稀释浓度时细胞出现CPE，而1:8及以下稀释浓度孵育的细胞均未出现CPE，因此采用1:8作为稀释度进行血清中和抗体效价实验。

15份男性HAdV55抗体阳性血清在1:8、1:16、1:32、1:64稀释浓度时分别有11、7、3、2份具有中和HAdV55感染的能力，随着稀释度的增加血清中和活性降低。4份女性HAdV55抗体阳性血清中，3份在1:8稀释度时有中和活性，1份在1:16和1:32稀释度时仍有中和活性，在1:64稀释度时均不能中和HAdV55感染。

19例阳性血清中和实验细胞经结晶紫染色，随机选取部分结果如图 1所示。1、2号血清在各稀释度均不能中和HAdV55的感染，3、6、7号血清在1:16稀释度时仍有中和活性，但在1:32稀释度时中和活性显著减弱，4、5号血清在1:64稀释度时仍能够中和HAdV55感染。

图 1 部分阳性血清各稀释度中和实验结果 Original magnification: ×100

HAdV感染在全球范围内广泛流行，具有传染性强、宿主范围广的特点。近几年，我国出现了多起HAdV感染的疫情，并且多发生于学校和部队。部队流行的HAdV感染以呼吸道感染为主，主要包括3型、7型、14型和55型HAdV。尤其是HAdV55，其由11型和14型重组而来，2006年在我国首次报道。近几年，部队常暴发HAdV55呼吸道感染疫情。2016年，我军西南地区部队暴发3起HAdV55感染的疫情，其症状以发热、咽痛、咳嗽为主，部分感染者伴随肺部影像学表现，感染后实行严格隔离和对症治疗，从初次发病到治愈需2~3周时间。由于其传播特点，起初的个别HAdV感染者往往迅速通过飞沫传播给营区的其他战友，给部队的训练和战备造成了重大影响^[6]。

HAdV感染属于自限性疾病，病毒感染人体后，机体可激发自身免疫力清除病毒。其免疫反应包括先天免疫反应和获得性免疫反应，其中获得性免疫反应产生的HAdV抗体对同型腺病毒具有长久、稳定的保护性。HAdV感染分为地方性感染、流行性感染和散发性感染3种感染方式，随着我国疾病监控机构和网络的不断完善，大范围的暴发感染都能被检测到，但散发性感染很难被检测，另外部分HAdV感染者为隐性感染。因此检测人群血清中的抗体有助于合理制定HAdV感染的防控措施。盛慧英^[9]检测了普通人群血清中的3型、4型和7型HAdV中和抗体，发现从7~20岁组开始，3型、4型和7型HAdV中和抗体阳性率显著上升；在20~40岁组人群中3型、4型和7型HAdV中和抗体阳性率分别为78%、57.5%和49.6%。Yu等^[10]报道普通人群中5型HAdV中和抗体阳性率约为50%，HAdV中和抗体阳性水平与地区、型别、人群等有关。

因此，调查部队官兵体内HAdV抗体流行率有助于了解官兵HAdV感染史和对HAdV感染的抵抗能力，为部队今后采用合理方案提高官兵预防HAdV感染提供参考。本研究采用ELISA法筛查血清样本中HAdV55抗体的流行情况，并进一步分析血清对HAdV55的中和活性。结果发现，HAdV55抗体在部队官兵体内阳性率较低，总体阳性率为5.85%。同时，研究还采集了本地区健康体检者血清样本，检测HAdV55抗体阳性率为17.8%（48/270，未发表数据），提示部队官兵中HAdV55抗体阳性率低于地方人群。19份抗体阳性的血清样本中，14份有中和活性，在体外能够中和HAdV55的感染，说明大部分官兵此前很长一段时间内未被HAdV55感染过，他们在一定程度上抵抗HAdV55感染的能力较弱。目前尚没有商品化的HAdV55抗体ELISA检测试剂盒，本实验采用了自制的ELISA检测试剂对部队官兵中HAdV55抗体的流行情况进行了检测，以血清标准品和HAdV55灭活病毒免疫小鼠血清进行前期验证实验，敏感性较好。本研究初步提示，西南地区官兵体内HAdV55抗体水平较低，一旦出现个别感染者，部队应加强对HAdV55感染的预防和控制，以防止感染的扩散。