微RNA（microRNA，miR）在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用，有可能成为早期肿瘤的诊断指标和治疗靶点^[1-7]。胰腺癌是一种早期确诊率低、预后差的恶性肿瘤，若能发现胰腺癌的特异性miR标志物，对疾病的早期诊断、治疗和预后评估均具有重要意义。检测miR的方法有多种，除了实时荧光定量PCR外，还有原位杂交（in situ hybridization，ISH）和基因芯片等方法^{[1-2, 8-13]}。由于ISH方法结合形态、定位准确，而10%中性甲醛溶液固定的石蜡包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE）组织中miR保存较完整^{[1, 6]}，因此用ISH方法检测FFPE胰腺癌组织中miR具有一定的优势，但针对FFPE胰腺癌组织切片的ISH检测未见文献报道。

因miR序列长度仅18~24核苷酸单位（nucleotide），标志物少、退火温度高，常导致杂交信号弱、信噪比差，用传统的ISH方法检测比较困难。本研究选择与胰腺癌关系密切的miR-21和miR-34a^{[10, 14]}，使用锁核酸（locked nucleic acid，LNA）标记的探针，以显色原位杂交（chromogenic in situ hybridization，CISH）技术检测miR-21和miR-34a的表达，并对杂交温度和杂交后的洗涤条件进行优化设置，以提高miR的阳性检出率。

选取2013至2015年在海军军医大学（第二军医大学）长海医院胰腺外科手术切除的胰腺癌组织标本126例。其中男91例，女35例；年龄为32~75岁，平均年龄60.4岁。纳入标准：（1）均为10% FFPE胰腺癌组织标本；（2）经病理学确诊为胰腺导管腺癌；（3）患者临床病理资料保存完整；（4）术前未行放射和化学治疗。排除标准：（1）合并其他原发性肿瘤；（2）临床病理资料不完整。其中68例病例具有配对的癌旁正常胰腺组织（距癌组织边缘＞1.5 cm）和癌旁的胰腺炎性增生病变组织。

将FFPE胰腺癌组织标本常规制成H-E切片，再根据H-E切片确定具有代表性的肿瘤部位及癌旁组织，应用商品化Recipient Block模块（1.5 mm，9×10；Quick-Ray）和手工Quick Ray组织芯片制作枪（韩国UINTMA公司）制备组织芯片。另外制作20例小样本的胰腺癌组织芯片用于杂交条件优化。

LNA标记的miR-21、miR-34a和scramble-miR（阴性对照）探针均购自美国Exiqon公司（表 1），浓度为25 µmol/L，用DEPC处理水1:10稀释，终浓度为2.5 µmol/L，取1 µL探针稀释到1 000 µL杂交缓冲液中。

表 1 (Tab 1)

表 1 LNA标记的miR-21、miR-34a和scramble-miR探针基本信息 Tab 1 Information of LNA-miR-21, miR-34a and scramble-miR probes Probe Product number Lot number LNA labeled probe sequence Temperature θ/℃ Dilution miR-21 38102-01 155426 5DigN/TCA ACA TCA GTC TGA TAA GCT A 53 1:1 000 miR-34a 38851-01 155436 5DigN/AGG GCA GTA TAC TTG CTG ATT G 56 1:800 Scramble-miR 99004-01 151998 5DigN/GTG TAA CAC GTC TAT ACG CCC A 57 1:1 000 LNA: Locked nucleic acid; miR: MicroRNA

表 1 LNA标记的miR-21、miR-34a和scramble-miR探针基本信息 Tab 1 Information of LNA-miR-21, miR-34a and scramble-miR probes

杂交缓冲液Ⅰ：溶解有10%硫酸葡聚糖的4×柠檬酸钠缓冲液，专用于miR-21和阴性探针；杂交缓冲液Ⅱ：含50%去离子甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、80 mmol/L TE、0.6 mol/LNaCl的Denhardt液，专用于miR-34a探针。

洗涤缓冲液Ⅰ：含0.1% Tween-20的柠檬酸钠缓冲液；洗涤缓冲液Ⅱ：含0.1% Tween-20的2×柠檬酸钠缓冲液；洗涤缓冲液Ⅲ：含0.1% Tween-20的4×柠檬酸钠缓冲液；0.01 mol/L PBS；TN缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 mol/L NaCl；TNB阻断缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 mol/L NaCl、0.5%（质量体积分数）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）；TNT缓冲液：0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）、0.15 mol/L NaCl、0.2% Triton X-100；3% H₂O₂-磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）。

阻断剂（批号：S16-PK1）、鼠抗地高辛抗体（批号：S17-QB1）、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多聚物（批号：S18-PL1）和DAB/H₂O₂均购自德国VytoVision公司。

分别设置不同杂交温度和不同杂交后洗涤条件进行杂交条件优化。杂交温度：A1为48 ℃，A2为53 ℃，A3为56 ℃。杂交后洗涤条件：B1为65 ℃下用洗涤缓冲液Ⅲ洗涤6 min，再用PBS洗涤1 min；B2为室温下分别用洗涤缓冲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各洗涤5 min，再用PBS洗涤1 min；B3为用洗涤缓冲液Ⅲ分别在4 ℃和65 ℃下各洗涤6 min，再用PBS洗涤1 min。

将构建的胰腺癌组织芯片以4 μm厚度连续切片（50~100片），制成ISH/免疫组织化学专用切片，经蜡封后贮藏于－40 ℃冰箱中备用。用时取出，在58~60 ℃烤箱烤片4 h，常规脱蜡至水，将杂交FFPE切片侵入0.01 mol/LpH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中，加热煮沸（96 ℃）8 min，自然冷却8 min，加入蛋白酶K（5 μg/mL，溶于0.02 mol/L pH 8.0 TE缓冲液）37 ℃孵育10 min；用PBS洗涤5 min，系列乙醇脱水、干燥后进行杂交。（1）预杂交：滴加不含探针的杂交缓冲液，37 ℃预杂交1 h。（2）杂交：不洗涤，分别滴加含不同探针的杂交缓冲液，加干净的合适盖玻片并用指甲油封边，分别于3个不同温度（A1、A2、A3）的恒温箱内杂交6 h。（3）杂交后洗涤：分别用3种洗涤方法（B1、B2、B3）进行洗涤。（4）IHC信号放大检测：用3% H₂O₂-PBS孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，用TNB阻断缓冲液和PBST各洗涤5 min；滴加鼠抗地高辛抗体，室温下孵育1 h，PBST洗涤5 min×2次；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG多聚物室温孵育1 h，PBST洗涤5 min×2次；DAB/H₂O₂显色15~30 min，流水冲洗，苏木精衬染，常规脱水透明封片。每组各设同步空白对照和scramble-miR阴性对照探针，scramble-miR阴性对照探针杂交温度以理论计算和公司提供信息为准，杂交温度设定为57 ℃。

阳性定位以细胞核、细胞质为主，大多数表达在细胞核内。判读采用染色强度和阳性细胞百分比二级计分法。染色强度：无着色计0分，浅黄色计1分，黄或深黄色计2分，黄褐色或棕褐色计3分。阳性细胞占比：无阳性细胞记0分，阳性细胞占1%~20%记1分，占21%~45%记2分，占46%~70%记3分，＞70%记4分。最终评分为染色强度和阳性细胞占比得分乘积，得分≤3分判读为（－），＞3分判读为（+）。连续切片评分以实验片得分除以对照片得分得到的相对数值表示，定义该相对数值≥0.75的组织为高表达，＜0.75的组织为低表达。

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分数表示，阳性强度的比较采用秩和检验（两两比较采用Nemenyi法）。检验水准（α）为0.05。

由图 1可见，miR-21以细胞核中染色为主，仅有少量在细胞质中表达；miR-21在所有癌组织中大部分肿瘤细胞中表达，而在周围基质中可见少量阳性表达；同步实验中，阴性对照和不含探针的空白对照均呈阴性表达。miR-34a的CISH结果与miR-21相似。由图 1和表 2可见，miR-21探针最佳杂交条件为A2B1，即杂交温度为53 ℃，杂交后洗涤条件为65 ℃下用洗涤缓冲液Ⅲ洗涤6 min、再用PBS洗涤1 min；miR-34a探针最佳杂交条件为A2B3，即杂交温度为53 ℃，杂交后洗涤条件为用洗涤缓冲液Ⅲ在4 ℃和65 ℃下各洗涤6 min、再用PBS洗涤1 min。

图 1 不同杂交条件下胰腺癌组织FFPE切片miR-21原位杂交结果 Fig 1 In situ hybridization results of miR-21 in FFPE pancreatic cancer tissue sections in different hybridization conditions A-I: In situ hybridization showing miR-21 positive expression using LNA-miR-21 probe under conditions of A1B1, A1B2, A1B3, A2B1, A2B2, A2B3, A3B1, A3B2 and A3B3, respectively; J, K: MiR-21 negative expression in synchronous experiment using scramble-miR probe (J) and without miR probe (K). A1-A3: Hybridization temperature (A1: 48 ℃; A2: 53 ℃; A3: 56 ℃); B1-B3: Hybridization washing conditions (B1: Washing using washing buffer Ⅲ at 65 ℃ for 6 min, and PBS for 1 min; B2: Washing using washing buffer Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ at room temperature for 5 min, respectively, and PBS for 1 min; B3: Washing using washing buffer Ⅲ at 4 ℃ and 65 ℃ for 6 min, respectively, and PBS for 1 min). FFPE: Formalin-fixed and paraffin-embedded; miR: MicroRNA; LNA: Locked nucleic acid. Original magnification: ×200

表 2 (Tab 2)

表 2 胰腺癌小样本组织芯片miR-21、miR-34a探针杂交条件的优化 Tab 2 Optimization of hybridization conditions of miR-21 and miR-34a probes in small sample pancreatic cancer tissue microarray N＝20 Pathologic diagnosis A1B1 A1B2 A1B3 A2B1 A2B2 A2B3 A3B1 A3B2 A3B3 hsa-miR-21                     Low expression n 3 3 6 4 12 11 4 3 7   High expression n 0 0 0 10 1 2 0 0 0   Positive expression rate n (%) 3 (15) 3 (15) 6 (30) 14 (70) 13 (65) 13 (65) 4 (20) 3 (15) 7 (35) hsa-miR-34a                     Low expression n 4 4 6 6 6 3 3 3 7   High expression n 0 0 0 5 4 10 0 0 0   Positive expression rate n (%) 4 (20) 4 (20) 6 (30) 11 (55) 10 (50) 13 (65) 3 (15) 3 (15) 7 (35) A1-A3: Hybridization temperature (A1: 48 ℃; A2: 53 ℃; A3: 56 ℃); B1-B3: Hybridization washing conditions (B1: Washing using washing buffer Ⅲ at 65 ℃ for 6 min, and PBS for 1 min; B2: Washing using washing buffer Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ at room temperature for 5 min, respectively, and PBS for 1 min; B3: Washing using washing buffer Ⅲ at 4 ℃ and 65 ℃ for 6 min, respectively, and PBS for 1 min). miR: MicroRNA

表 2 胰腺癌小样本组织芯片miR-21、miR-34a探针杂交条件的优化 Tab 2 Optimization of hybridization conditions of miR-21 and miR-34a probes in small sample pancreatic cancer tissue microarray

在126例胰腺癌组织中，84例（66.7%）miR-21呈阳性表达，其中70例为低表达，14例为高表达；miR-21在癌旁正常胰腺组织（8.8%，6/68）和癌旁的胰腺炎性增生病变组织（26.5%，18/68）中表达较少且均未见高表达，与胰腺癌组织相比差异均有统计学意义（P均＜0.01）。在126例胰腺癌组织中，77例（61.1%）miR-34a呈阳性表达，其中65例为低表达，12例为高表达；miR-34a在癌旁正常胰腺组织（7.4%，5/68）和癌旁的胰腺炎性增生病变组织（26.5%，18/68）中表达较少且均未见高表达，与胰腺癌组织相比差异均有统计学意义（P均＜0.01）。

ISH是基因表达和基因功能分析的一个重要工具，而FFPE切片是回顾性研究的主要切片形式。影响FFPE切片ISH结果的技术因素很多，例如固定、核酸与蛋白的分离（酶消化与高温修复）、探针上的标记量等，但针对miR检测最重要的因素之一是选择最适的杂交温度和杂交后的洗涤条件^{[2, 7, 15]}。此外，用传统的探针标记方法检测miR比较困难，因标志物少、退火温度高等因素，导致杂交信号弱、信噪比差。利用LNA标记miR可以很好地解决这些缺陷。这是因为LNA是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2′氧原子可与核糖支架上的4′碳原子结合以锁住杂交体的两部分，这样可以增加解链温度；但是由于LNA探针产生复合体的稳定性与miR的互补性，导致杂交信号下降、杂交背景增加，因此在杂交过程中应设计严格的杂交温度和洗涤条件^[14-15]。

杂交温度的选择是ISH杂交成败的关键因素之一。教科书上推荐的RNA检测的杂交温是48 ℃；各miR探针因GC含量不同，其理论推荐的杂交温度差异较大。从理论上分析，若反应温度低于杂交温度10~15 ℃，碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链，错配碱基对减少；若反应温度再低（低于杂交温度30 ℃），虽然互补链之间也可形成稳定的双链，但互补碱基对减少，错配碱基对增多，氢链之间的结合更弱；调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化10倍，因此在实验前必须首先确定杂交温度。

LNA标记的miR探针因标记技术的改进，其最佳的杂交温度是根据出厂时理论计算与杂交缓冲液中盐浓度推荐的杂交温度减去30 ℃，本研究使用的miR-21和miR-34a理论杂交温度分别53 ℃和56 ℃。但是在具体实验时，使用的杂交缓冲液成分不一定与推荐的成分一致，而且杂交温度过高会对组织形态产生不利影响，因此需要结合具体情况调整。Nuovo等^[16]推荐了几种miR原位检测流程及其调整方法，认为可以通过增加某些成分的浓度来调整杂交温度，例如50%甲酰胺可以降低杂交温度2~3 ℃。本研究使用的miR-34a探针理论推荐杂交温度为56 ℃（86 ℃－30 ℃），预实验中我们使用两种含有不同离子浓度的杂交缓冲液及相对应的杂交温度，结果发现使用杂交缓冲液Ⅰ在56 ℃下杂交6 h和使用杂交缓冲液Ⅱ在53 ℃下杂交6 h，其阳性信号与强度基本一致。本研究中选择了48、53和56 ℃ 3个杂交温度进行条件优化。

洗涤条件也是影响ISH结果的重要因素。Nuovo等^[16]推荐了几种常见的杂交后洗涤缓冲液和洗涤温度，但未论述其原理，具体实验时仍然需要根据具体情况进行模索。本研究根据购买探针厂家推荐的、本实验室经常使用的或其他CISH试剂盒中经常使用的洗涤条件，设置了3种洗涤条件进行杂交条件优化。

本研究制作了20例胰腺癌组织的小样本组织芯片，对杂交条件进行优化。结果显示miR-21探针的最佳杂交条件为A2B1，即在杂交温度53 ℃（使用杂交缓冲液Ⅰ）下杂交6 h，使用洗涤缓冲液Ⅲ在65 ℃下洗涤6 min，再用PBS洗涤1 min；miR-34a探针最佳杂交条件为A2B3，即在杂交温度53 ℃（使用杂交缓冲液Ⅱ）下杂交6 h，用洗涤缓冲液Ⅲ分别在4 ℃和65 ℃下各洗涤6 min，再用PBS洗涤1 min。采用上述优化条件，用miR-21和miR-34a探针检测126例胰腺癌组织标本构建的组织芯片，发现84例（66.7%）miR-21呈阳性表达，其中70例为低表达、14例为高表达；77例（61.1%）miR-34a呈阳性表达，其中65例为低表达、12例为高表达。miR-21和miR-34a在癌旁正常胰腺组织和癌旁的胰腺炎性增生病变组织中表达较少且均未见高表达。

既往研究多通过血清学PCR法及新鲜组织miR微阵列结合PCR法等检测miR的表达，Fu等^[17]对既往文献进行了meta分析，结果表明miR-21几乎在所有实体肿瘤包括胰腺癌组织中呈高表达，而且高表达的miR-21可能发挥类似原癌基因的作用且与胰腺导管癌的总生存期有关。本研究采用CISH技术检测发现miR-21在胰腺癌组织中的阳性率达66.7%，且高于癌旁正常组织和癌旁的胰腺炎性增生病变组织，与上述文献报道结果一致。胰腺导管腺癌组织miR-34a的原位检测方法未见文献报道，Pramanik等^[18]采用PCR法检测miR-34a，结果发现其在大多数胰腺癌样本中的表达缺失。我们前期研究也采用PCR法检测了胰腺癌组织中miR-34a的表达，结果发现其在胰腺癌组织中表达水平低，且与胰腺癌分化程度高度相关^[10]。本实验方法的结果表明miR-34a表达阳性率为61.1%，但低表达组占比较高（84.41%，65/77），与既往文献报道有一定差异，其原因有待进一步分析。

综上所述，本研究发现在FFPE胰腺癌组织切片miR的检测中，miR-21和miR-34a的最佳杂交温度均为53 ℃，选择合适的杂交后洗涤温度和洗涤缓冲液有利于提高miR的阳性检出率。本研究为后续在组织水平研究miR-21和miR-34a在胰腺癌发生和发展中的作用奠定了基础。