糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常见的微血管并发症之一, 糖尿病发展10年后约60%的患者会进展到增殖期DR, 约35%的患者会致盲^[1]。因此, 建立用于反映疾病病理特征的DR动物模型, 对于找到更好的DR治疗方法是必不可少的^[2]。四氧嘧啶、链脲佐菌素(streptozocin, STZ)、地塞米松、肾上腺素等药物均可成功诱导小鼠DR模型, 其中STZ构建DR模型的成功率高, 因此STZ诱导小鼠DR模型被广泛应用^[3]。STZ通过对胰岛β细胞DNA的烷基化作用破坏胰岛β细胞, 使之合成分泌胰岛素不足, 诱发糖尿病^[4]。进而, 糖尿病小鼠在高血糖状态下通过一系列途径诱发视网膜病变。然而, 该动物模型的诱导成功率受诸如STZ的制备和施用途径、STZ剂量、动物年龄、性别等因素的影响, 尤其是高剂量的STZ会引起小鼠死亡^[5-6]。

STZ首先将胰岛β细胞DNA碱基上的特殊位点烷基化, 进一步作用于ADP核糖体合成酶, 从而损伤胰岛β细胞, 使β细胞数量明显减少。残存的β细胞几乎完全脱颗粒, 胰岛素合成和分泌减少, 引起糖代谢紊乱致血糖升高^[4]。

STZ是一种含亚硝基的化合物, 可以诱导一氧化氮(nitric oxide, NO)的合成、释放抑制DNA保护酶, 导致DNA的损伤; 且可以通过抑制顺乌头酸酶合成影响线粒体氧化呼吸复合物, 导致线粒体能量供应紊乱, 增加对胰岛β细胞的氧化侵袭而特异性破坏胰岛β细胞, 从而导致糖代谢紊乱^[3]。

STZ诱导的小鼠糖尿病模型在早期阶段会产生氧自由基, 如超氧阴离子自由基(• O^2-)、过氧化氢(H₂O₂)、羟自由基(• OH)等会引起小鼠体内促氧化剂和抗氧化剂失衡导致氧化应激, 并与NO途径相互作用导致β细胞破坏, 引起糖代谢紊乱^[7]。

单次大剂量注射STZ可引起快速的大量胰岛β细胞坏死, 通常诱导形成1型糖尿病模型; 多次低剂量注射则造成部分胰岛β细胞损伤, 激发炎症反应, 从而导致胰岛β细胞迅速失活, 其同样诱导为1型糖尿病模型^[8]。

视网膜毛细血管主要由内皮细胞和周细胞组成, 后者的主要作用是调节视网膜毛细血管局部血流量和血管通透性, 并可以抑制内皮细胞的增殖。可在电镜下观察到DR模型中毛细血管基底膜增厚, 周细胞线粒体肿胀, 细胞核内染色质浓缩, 细胞质空泡化, 细胞器消失。视网膜神经细胞也会因微环境改变而发生病理变化, 视网膜中的胶质细胞处于神经元和血管之间, 对传递环境信息有非常重要的作用, 而DR动物模型中星形胶质细胞明显减少^[9]。

长期高血糖引起机体蛋白质非酶糖化, 形成的糖基化终产物(advanced glycation end product, AGE)大量堆积是导致视网膜毛细血管周细胞凋亡和DR发生的主要原因^[10]。糖化血红蛋白含量与红细胞聚集速度呈正相关, 大量红细胞聚集易使微小动脉形成血栓; 糖化血红蛋白对氧的亲和力增大, 氧解离速率降低, 使组织缺氧, 诱发多种血管生长因子表达增加, 这是DR发生和进展的基础^[11]。缺血、缺氧可导致光感受器和双极细胞层水肿和增厚, 色素上皮层细胞水肿以及双极细胞排列紊乱^[12]。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是介导新生血管的主要生长因子, 小鼠DR模型诱导成功5个月后, VEGF及其受体2表达明显升高。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一类调控蛋白, 其可以使细胞外基质降低而促进VEGF分泌, 在DR模型中MMP-2和MMP-9表达增加^[13]。

高血糖导致的视网膜毛细血管渗漏主要是由VEGF介导, VEGF通过升高内皮细胞内Ca²⁺和氧自由基的浓度增加谷氨酰胺转移酶2(transglutaminase 2, TGase2)的活性, 促进应力纤维的形成和钙黏蛋白的降解。在实验动物玻璃体内注射TGase2抑制剂后, 血管渗漏情况明显减轻, 证明TGase2在DR过程中扮演着要角色^[14]。

STZ是一种可溶于水、醇和酮的亲水化合物, 在pH 4.5的酸性溶液中较稳定, 在pH＞4.5的环境下降解^[5]。最好将STZ溶于冰的pH 4.5柠檬酸钠缓冲液中, STZ见光易分解, 应避光保存^[15]。STZ溶液最好在制备后15~20 min内注射到动物体内, 以防止其降解。STZ溶液可在黑暗、4 ℃的条件下保存40 d, 但以每天0.1%的速率降解^[16]。

STZ的致糖尿病活性在不同品种、性别和年龄的动物中不同, 这可能与胰岛β细胞的损伤和修复等机制有关^[17]。用小鼠、大鼠、猴子、豚鼠、仓鼠、狗和猫均可成功诱导糖尿病模型, 其临床特征和病理改变均与人糖尿病类似^[18]。葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2, GLUT2)的表达是区别不同种类动物对STZ致糖尿病作用敏感性的关键因素, GLUT2可特异性地将STZ吸收到胰岛β细胞加强STZ的致糖尿病作用, 大多数啮齿类动物有GLUT2表达, 而人体因不表达或很少表达GLUT2而有抗STZ致糖尿病的作用。考虑到动物体型的大小、操作的难易度、实验动物成本和诱导成功率, 通常选择小鼠诱导DR模型。某些种类的大鼠如Wistar-Kyoto大鼠对STZ的作用具有抗性, 这可能是由于Wistar-Kyoto大鼠中有高脂蛋白脂肪酶库^[19]。8~10周龄、处于青春期的小鼠对STZ的致糖尿病作用较敏感, 而性未成熟的小鼠敏感性较低^[20]。雄性小鼠对STZ致糖尿病作用的敏感性比雌性小鼠高, 这可能与两者的激素差异有关。雌激素在控制糖代谢过程中起着关键作用, STZ诱导成功的糖尿病小鼠模型使用外源雌激素后血糖可降至正常水平^[5]。

STZ的剂量是其致高血糖作用的决定性因素, 不同动物使用剂量不同。在较低剂量下STZ可能不会引起糖尿病, 而在较高剂量时又可能导致动物死亡。不同动物个体应选择最佳STZ剂量诱导DR。通常低于60 mg/kg剂量的STZ可引起高血糖的可逆升高, 而高于200 mg/kg剂量则会导致小鼠死亡, 研究表明小鼠最佳诱导剂量是55 mg/kg^[5]。多次低剂量STZ注射后予以高脂饮食可引起胰岛素抵抗^[21]。STZ的作用取决于其生物利用度, 给药途径同样是诱导DR动物模型的关键因素。消化道中的酶和其强酸环境会使STZ降解, 因此不可口服STZ。饮食是决定动物体内血糖水平的因素之一, 因此要建立稳定的糖尿病模型需要给予适当的高脂饮食。在注射STZ前小鼠需要禁食4 h, 在测量血糖浓度之前需要禁食24 h^[22]。腹腔内注射和静脉注射两种方式均可成功诱导STZ剂量依赖的DR动物模型。进行腹腔注射STZ时有可能将其注射至腹膜腔内, 会导致实验动物死亡, 因此静脉注射是比腹腔注射更加稳定的方法^[23]。相比多次低剂量注射诱导产生的糖尿病模型, 其病理变化过程与人的糖尿病病理变化更相似。在高脂饮食4周后腹腔注射较低剂量(45 mg/kg)STZ, 其诱导成功率升高^[24]。

STZ诱导小鼠DR模型的主要缺点是持续时间长, 这增加了实验成本^[25]。STZ有细胞毒性, 可以破坏心脏、肾脏、中枢神经系统等重要脏器的功能, 导致实验动物剂量依赖性死亡^[11]。STZ剂量高于200 mg/kg会导致小鼠死亡^[5]。实验动物有STZ中毒现象时可以通过注射药物降低实验动物的死亡率, 如他克林可以作为糖基清除剂在注射STZ后使用^[26]。通过改进实验方法, 也可以降低实验动物的死亡率, 如选择实验动物时尽量选用雄性小鼠, 小鼠周龄要达到性成熟期(尽量在8~9周龄), 采用高脂饮食伴注射较低剂量STZ的方式, 或尽量采用静脉注射等。

STZ诱导的小鼠DR模型的临床特征和病理变化与人的DR相似, 所以该模型经常被用来研究DR的发病机制以及进行新型抗DR药物的临床前评估。通过研究实验方法和STZ局限性可以对原有的实验方法进行改进, 找到解决其中问题的方法, 提高诱导模型的成功率。