2018, Vol. 39
2. 苏州大学附属第三医院综合实验室, 常州 213003
2. Department of Integrated Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Soochow University, Changzhou 213003, Jiangsu, China
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一种以持续气流受限为特征的疾病, 与气道和肺对有害颗粒和(或)气体的慢性炎症反应增强有关。据全球疾病负担研究(The Global Burden of Disease Study)估计, 2020年COPD将位居全球死亡原因的第3位[1]。
载脂蛋白M(apolipoprotein M, apoM)相对分子质量为26 000, 属于脂质运载蛋白(lipocalin)超家族[2]。ApoM基因位于6号染色体组织相容性复合体Ⅲ区, 非常靠近肿瘤坏死因子α和淋巴毒素基因, 该区存在很多与免疫反应有关的基因。ApoM基因定位提示该基因可能与机体的免疫反应有关。Feingold等[3]研究表明, apoM广泛参与机体的免疫炎症反应, 在感染和炎症反应时血清apoM水平发生改变。Burkart等[4]经meta分析后发现一些apoM侧翼单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点与肺功能和肺气肿相关。Li等[5]证明COPD患者血清apoM水平增高, 增高程度与COPD严重程度相关。我们推测apoM基因SNP与COPD易感性相关, 前期利用第二代测序技术筛选出apoM基因突变频率＞20%的高可信突变位点rs805264、rs707922和rs707921, 并认为其可能与COPD发病相关[6]。本研究采用碱基淬灭探针技术检测并对比COPD患者和健康对照apoM基因rs805264、rs707922和rs707921位点的基因型频率和等位基因频率的分布差异, 初步探索apoM基因的SNP在部分中国人群中是否与COPD易感性存在联系, 为COPD的易感基因筛查提供实验室依据。
1 对象和方法 1.1 研究对象COPD组为2014年6月至2016年12月就诊于苏州大学附属第三医院呼吸内科的COPD患者256例, 对照组为同期于苏州大学附属第三医院体检中心进行健康体检的健康人248例。COPD组纳入标准:符合2016年《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[7] COPD诊断标准, 且第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second, FEV1)/用力呼气容积(forced vital capacity, FVC)＜0.7。对照组纳入标准:经呼吸内科医师临床问诊及体格检查、胸部X线检查、肺功能检查均无异常。排除标准:肺结核、支气管扩张、间质性肺疾病、哮喘等呼吸系统疾病, 严重肝、肾功能损伤等, 结缔组织疾病如类风湿性关节炎等, 各系统良恶性肿瘤等。本研究为回顾性病例对照研究, 所有入组者均遵循自愿参加原则并签署知情同意书, 研究方案通过苏州大学附属第三医院伦理委员会审批。
1.2 研究指标 1.2.1 人口学特征收集患者的性别、年龄, 性别依据生理学特征分为男和女; 根据COPD发病特点, 纳入年龄为40岁及以上的符合纳入标准的研究对象。
1.2.2 吸烟史有吸烟史定义为已吸烟10年及以上且每日吸烟≥20支, 即吸烟指数≥200支年。
1.2.3 COPD综合评估根据临床表现、慢性阻塞性肺疾病评估测试(chronic obstructive pulmonary disease assessment test, CAT)评分、改良的英国医学研究委员会呼吸困难量表(modified British Medical Research Council dyspnea scale, mMRC)评分、改良的每年加重次数将患者分为4组(A组、B组、C组、D组)。A组即症状少、风险低, CAT评分＜10分, mMRC评分＜2分, 每年加重次数＜2次; B组即症状多、风险低, CAT评分≥10分, mMRC评分≥2分, 每年加重次数＜2次; C组即症状少、风险高, CAT评分＜10分, mMRC评分＜2分, 每年加重次数≥2次; D组即症状多、风险高, CAT评分≥10分, mMRC评分≥2分, 每年加重次数≥2次。
1.2.4 ApoM基因rs805264、rs707922和rs707921位点的基因型及等位基因rs805264基因型为GG、GA和AA, 等位基因为G和A; rs707922基因型为GG、GT和TT, 等位基因为G和T; rs707921基因型为CC、CA和AA, 等位基因为C和A。
1.3 研究方法 1.3.1 DNA抽提所有受试者于禁食后空腹抽取外周静脉血2 mL, 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝, -80 ℃保存。采用上海申能博彩生物科技有限公司DNA纯化试剂盒提取基因组DNA, 并于-20 ℃保存。
1.3.2 ApoM基因SNP检测采用碱基淬灭探针技术检测SNP。rs805264、rs707922及rs707921位点的上游引物、下游引物和探针见表 1, 其中下划线部分为突变位点。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR总反应体系为25 μL, 含2 μL模板DNA、2.5 μL 10×缓冲液、1.5 μL 25 μmol/L MgCl2、0.5 μL 4×dNTPs、0.25 μL5 U/μL Taq DNA聚合酶、17.95 μL ddH2O、100 μmol/L上下游引物各0.1 μL和10 μmol/L探针0.1 μL。PCR在德国罗氏公司LightCycler® 480型实时荧光定量PCR仪上进行。循环反应条件为95 ℃变性2 min, 95 ℃ 2 s, 60 ℃ 1 min, 温度转换率均为20 ℃/s, 共40个循环; 扩增产物的熔解曲线分析条件为95 ℃ 30 s、25 ℃ 4 min, 逐渐升至70 ℃时, 温度转换率均为0.1 ℃/s, 并持续收集荧光数据。
|
表 1 ApoM基因rs805264、rs707922和rs707921位点引物和探针序列 Tab 1 Sequences of primers and probes of apoM gene rs805264, rs707922 and rs707921 loci |
1.3.3 基因型判读
根据碱基淬灭探针技术结合熔解曲线分别对rs805264、rs707922和rs707921位点的基因型进行判别。碱基淬灭探针技术[8]是一种成本低、效率高、操作简便的单核苷酸检测技术, 基本方法为参照待测SNP所在DNA序列设计并合成引物及探针, 探针的一端标记6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, 6-FAM), 依据碱基淬灭荧光的原理, 应用PCR技术结合熔解曲线的方法进行SNP分型。该方法仅需l对引物和1条单荧光标记的探针。标有荧光基团的寡核苷酸序列游离在反应体系中时发出强烈荧光, 当它与互补序列配对时, 荧光强度随之减弱。PCR结束时, 碱基淬灭探针与靶DNA序列在较低温度条件下(如30 ℃或42 ℃)杂交(图 1A左), 6-FAM发出的荧光被邻近的碱基(A、T、C或G)淬灭; 当温度慢慢升高时探针熔解脱离靶DNA(图 1A右), 荧光急剧增加, 不同等位基因间熔解温度有明显差异。在基因扩增检测仪上, 纯合子标本会呈现单一熔解谷, 不同等位基因的纯合子会在不同温度处各出现1个熔解谷, 杂合子则可见2个熔解谷, 由1个碱基错配而造成的温度漂移通常在7 ℃左右, 很容易识别。rs805264、rs707922、rs707921位点基因分型的熔解曲线见图 1B~1D。
|
图 1 碱基淬灭探针技术检测SNP原理图和基因分型熔解曲线图 Fig 1 Schematic diagram of base-quenched probe technique detecting SNP and melting curves of SNP genotypes A:Schematic diagram of base-quenched probe technique detecting SNP; B-D:Melting curves of rs805264, rs707922 and rs707921 genotypes, respectively.SNP:Single nucleotide polymorphism; F:Fluorescence |
1.4 统计学处理
运用Hardy-Weinberg平衡检验检测样本的群体代表性, P＞0.05为该群体的基因型符合遗传学平衡定律, 即样本具有群体遗传代表性。所有实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示, COPD组与对照组比较采用两独立样本t检验; 基因型、等位基因频率等计数资料以例数和百分数表示, 两组间比较采用χ2检验。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 研究对象的一般资料256例COPD患者中男185例、女71例, 年龄为(67.7±8.4)岁。其中A组98例, 男74例、女24例, 年龄在40~49岁者2例、50~59岁者10例、60~69岁者61例、≥70岁者25例, 有吸烟史者62例, 吸烟指数＜200支年者36例、200~400支年者10例、＞400支年者52例。B组78例, 男52例、女26例, 年龄在40~49岁者1例、50~59岁者8例、60~69岁者38例、≥70岁者31例, 有吸烟史者40例, 吸烟指数＜200支年者38例、200~400支年者5例、＞400支年者35例。C组16例, 男9例、女7例, 年龄在50~59岁者5例、60~69岁者5例、≥70岁者6例, 有吸烟史者7例, 吸烟指数＜200支年者9例、200~400支年者1例、＞400支年者6例。D组64例, 男50例、女14例, 年龄在40~49岁者2例、50~59岁者7例、60~69岁者24例、≥70岁者31例, 有吸烟史者43例, 吸烟指数＜200支年者21例、200~400支年者6例、＞400支年者37例。248名健康对照中男173名、女75名, 年龄为(67.1±8.8)岁, 有吸烟史者159名。两组间性别、年龄、吸烟史比较差异均无统计学意义(P均＞0.05), 具有可比性, 详见表 2。
|
|
表 2 COPD组及对照组的一般资料 Tab 2 General characteristics of COPD patients and healthy controls |
2.2 ApoM基因型频率分布与COPD相关性分析
COPD组和对照组apoM基因rs805264、rs707922及rs707921位点基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(COPD组χ2=3.46、1.01、3.83, P=0.063、0.315、0.051;对照组χ2=1.36、1.05、0.68, P=0.243、0.307、0.410), 具有群体代表性。见表 3, COPD组rs805264位点GG、GA、AA基因型频率分别为190(74.2%)、65(25.4%)、1(0.4%), 对照组分别为186(75.0%)、55(22.2%)、7(2.8%); COPD组rs707922位点GG、GT、TT基因型频率分别为181(70.7%)、71(27.7%)、4(1.6%), 对照组分别为175(70.6%)、64(25.8%)、9(3.6%); COPD组rs707921位点CC、CA、AA基因型频率分别为188(73.4%)、67(26.2%)、1(0.4%), 对照组分别为182(73.4%)、59(23.8%)、7(2.8%); 两组各位点3种基因型频率分布差异均无统计学意义(P均＞0.05)。进一步分析表明, COPD组rs805264位点的AA纯合子基因型频率低于对照组, GG+GA基因型频率高于对照组, 差异有统计学意义(χ2=4.769, P=0.029), 表明rs805264位点AA纯合子基因型对COPD易感人群可能有一定保护作用; COPD组rs707921的AA纯合子基因型频率低于对照组, CC+CA基因型频率高于对照组, 差异有统计学意义(χ2=4.769, P=0.029), 表明rs707921的AA纯合子基因型可能是COPD的保护性因素。
|
|
表 3 COPD组和对照组apoM基因型频率分布 Tab 3 Distribution of apoM gene genotype in COPD and control groups |
2.3 ApoM等位基因频率分布与COPD相关性分析
COPD组和对照组apoM基因rs805264、rs707922、rs707921位点等位基因频率分布差异均无统计学意义(P均＞0.05), 见表 4。
|
|
表 4 ApoM等位基因频率分布与COPD相关性分析 Tab 4 Correlation analysis of apoM allele frequency distribution and COPD |
2.4 ApoM基因rs805264、rs707922、rs707921位点的连锁不平衡分析
AopM基因rs805264、rs707922、rs707921位点连锁程度经SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)分析, 结果(表 5)示rs805264位点与rs707921位点及rs707922位点与rs707921位点呈强连锁不平衡(D’均＞0.8, r2均＞0.8);rs805264与rs707922呈完全连锁不平衡(D’=1.000, r2=0.820)。且rs805264位点、rs707922位点及rs707921位点的等位基因G-G-C及A-T-A紧密连锁。
|
|
表 5 AopM基因rs805264、rs707922、rs707921位点的连锁不平衡分析 Tab 5 Linkage disequilibrium analysis of apoM gene rs805264, rs707922 and rs707921 loci |
3 讨论
COPD的发病机制较为复杂, 且个体之间发病易感性差异较大。吸烟已被证实为COPD发病最主要的危险因素, 但流行病学研究发现仅有10%~20%的吸烟者发展为具有临床症状的COPD[9], 并且COPD和肺功能受损具有家族聚集倾向, 另外不同国家、不同民族COPD的发病率也不同[10]。随着基因组学的深入研究及人类全基因组测序的完成, 从基因水平分析疾病发病机制及遗传易感性、揭示遗传因素与疾病的相关性成为研究者关注的焦点。本研究旨在通过对apoM基因SNP的研究, 进一步探索COPD患者的遗传背景, 为早期识别社区风险群体和发展新的个体化的治疗靶点提供依据。
组织病理学研究证实, COPD患者细支气管和肺实质组织有明显的炎症反应, 肺实质损伤部位和支气管灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞和CD8+T淋巴细胞过度增加[11-12]。ApoM由Xu和Dahlbäck[13]在1999年发现, 主要存在于高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)中。研究证明了apoM/HDL-胆固醇途径在COPD和肺气肿的发病机制中的新型效应, 较高水平的HDL与较低的FEV1/FVC和肺气肿发病相关[4]。ApoM/HDL可能通过以下3个途径参与COPD尤其是肺气肿的发生和进展:(1)HDL通过抑制肿瘤坏死因子刺激人类内皮细胞中鞘氨醇激酶的活性, 从而增加神经酰胺、降低鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate, S1P)的水平[4]。动物实验研究表明, 神经酰胺上调可以增加肺细胞凋亡和肺气肿型疾病的发生[14]。(2)血浆中HDL-apoM将S1P呈递给S1P1受体发挥内皮细胞保护作用[15]。S1P在维持肺血管内皮屏障完整性和抑制肺气肿的发病中起重要作用。(3)HDL结合α1-抗胰蛋白酶可以抑制血管平滑肌细胞外基质的降解和细胞凋亡[16]。研究认为, apoM是一种负性急性时相反应蛋白, 发生全身炎症以及败血症时, apoM基因表达减少[3, 17]。在慢性全身炎症过程中, apoM作为先天性保护机制的一部分, 其基因表达可能会补偿甚至上调。在COPD患者中, apoM可能通过其疏水性信号肽锚定在脂蛋白的表面, 完成在血清脂蛋白库内重新分布[18]。Li等[5]研究发现, COPD患者中apoM表达增加, 且血清apoM水平与FEV1/FVC呈负相关, 表明血清apoM是COPD发病的预测因素, 且气流阻塞和apoM mRNA水平呈反向关系。
ApoM基因定位于6号染色体短臂p21.31, 是单拷贝基因, 包括6个外显子和5个内含子。rs805264定位于第1内含子, rs707922和rs707921定位于第5内含子。本研究应用碱基淬灭探针技术检测rs805264、rs707922及rs707921位点的基因型, 发现rs805264位点AA与GG+GA基因型和rs707921位点AA与CC+CA基因型频率分布的差异均有统计学意义(P均=0.029), 提示apoM基因rs805264位点和rs707921位点与COPD易感性相关, 且rs805264位点和rs707921位点的AA基因型可能为COPD的保护性因素。COPD组和对照组rs707922位点基因型频率和等位基因频率分布差异无统计学意义, 提示rs707922位点基因多态性与COPD易感性无关。其原因可能为:(1)该多态性位点定位于第5内含子, 但其对基因表达的影响与rs805264及rs707921不同; (2)本实验样本量不够大, 产生Ⅱ型错误的可能性增加, 可能导致假阴性的结论。rs805264、rs707922及rs707921位点3个基因座之间存在强连锁不平衡, 与韩秀杰和贾建平[19]对中国北方汉族人SNP的连锁不平衡研究结果一致, 且rs805264、rs707922及rs707921位点的等位基因G-G-C及A-T-A紧密连锁。rs805264、rs707922及rs707921位点均位于内含子, 说明apoM基因部分定位于内含子的多态性位点影响COPD易感性, 内含子上SNP位点可能会影响基因拼接及基因表达, 但其对基因产物产生何种影响尚不明确; 3个多态性位点间的强连锁不平衡对其基因功能的影响也不明确。因此, 后续研究需要进一步增加样本量并结合更多影响因素对其进行分层分析和深入研究。
| [1] |
MURRAY C J L, LOPEZ A D. Evidence-based health policy-lessons from the Global Burden of Disease Study[J]. Science, 1996, 274: 740-743. DOI:10.1126/science.274.5288.740 |
| [2] |
DUAN J, DAHLBÄCK B, VILLOUTREIX B O. Proposed lipocalin fold for apolipoprotein M based on bioinformatics and site-directed mutagenesis[J]. FEBS Lett, 2001, 499(1/2): 127-132. |
| [3] |
FEINGOLD K R, SHIGENAGQ J K, CHUI L G, MOSER A, KHOVIDHUNKIT W, GRUNFELD C. Infection and inflammation decrease apolipoprotein M expression[J]. Atherosclerosis, 2008, 199: 19-26. DOI:10.1016/j.atherosclerosis.2007.10.007 |
| [4] |
BURKART K M, MANICHAIKUL A, WILK J B, AHMED F S, BURKE G L, ENRIGHT P, et al. APOM and high-density lipoprotein cholesterol are associated with lung function and percent emphysema[J]. Eur Respir J, 2013, 43: 1003-1017. |
| [5] |
LI H, LIU Y, WANG L, SHEN T, DU W, LIU Z, et al. High apolipoprotein M serum levels correlate with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Lipids Health Dis, 2016, 15: 1-7. DOI:10.1186/s12944-015-0172-5 |
| [6] |
YU Y, ZHANG J, QIAO Y, PAN L, LI J, MAO H, et al. Apolipoprotein M gene single nucleotide polymorphisms discovery in patients with chronic obstructive pulmonary disease and determined by the base-quenched probe technique[J]. Gene, 2017, 637: 9-13. DOI:10.1016/j.gene.2017.09.029 |
| [7] |
Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of COPD.Scientific information and recommendations for COPD programs (Updated 2016)[DB/OL].[2017-03-09].https://goldcopd.org.
|
| [8] |
张俊, 罗光华, 郑璐, 张晓膺, 徐宁. 单核苷酸多态性的碱基淬灭探针技术检测方法的建立[J]. 中华检验医学杂志, 2009, 32: 1064-1068. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2009.09.025 |
| [9] |
JEFFERY P K. Differences and similarities between chronic obstructive pulmonary disease and asthma[J]. Clin Exp Allergy, 1999, 29(Suppl 2): 14-26. |
| [10] |
BUIST A S, MCBURNIE M A, VOLLMER W M, GILLESPIE S, BURNEY P, MANNINO D M, et al. International variation in the prevalence of COPD (the BOLD Study):a population-based prevalence study[J]. Lancet, 2007, 370: 741-750. DOI:10.1016/S0140-6736(07)61377-4 |
| [11] |
SEEMUNGAL T, HARPER-OWEN R, BHOWMIK A, MORIC I, SANDERSON G, MESSAGE S, et al. Respiratory viruses, symptoms, and inflammatory markers in acute exacerbations and stable chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 164: 1618-1623. DOI:10.1164/ajrccm.164.9.2105011 |
| [12] |
SAETTE M, DI STEFANO A, TURATO G, FACCHINI F M, CORBINO L, MAPP C E, et al. CD8+ T-lymphocytes in peripheral airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1998, 157(3 Pt 1): 822-826. |
| [13] |
XU N, DAHLBÄCK B. A novel human apolipoprotein (apoM)[J]. J Biol Chem, 1999, 274: 31286-31290. DOI:10.1074/jbc.274.44.31286 |
| [14] |
PETRACHE I, NATARAJAN V, ZHEN L, MEDLER T R, RICHTE A T, CHO C, et al. Ceramide upregulation causes pulmonary cell apoptosis and emphysema-like disease in mice[J]. Nat Med, 2005, 11: 491-498. DOI:10.1038/nm1238 |
| [15] |
ARKENSTEIJN B W, BERBÉE J F, RENSEN P C, NIELSEN L B, CHRISTOFFERSEN C. The apolipoprotein M-sphingosine-1-phosphate axis:biological relevance in lipoprotein metabolism, lipid disorders and atherosclerosis[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14: 4419-4431. DOI:10.3390/ijms14034419 |
| [16] |
ORTIZ-MUÑOZ G, HOUARD X, MARTÍN-VENTURA J L, ISHIDA B Y, LOYAU S, ROSSIGNOL P, et al. HDL antielastase activity prevents smooth muscle cell anoikis, a potential new antiatherogenic property[J]. FASEB J, 2009, 23: 3129-3139. DOI:10.1096/fj.08-127928 |
| [17] |
KUMARASWAMY S B, LINDER A, ÅKESSON P, DAHLBÄCK B.Decreased plasma concentrations of apolipoprotein M in sepsis and systemic inflammatory response syndromes[J/OL].Crit Care, 2012, 16: R60.doi: 10.1186/cc11305.
|
| [18] |
CHRISTOFFERSEN C, AHNSTRÖM J, AXLER O, CHRISTENSEN E I, DAHLBÄCK B, NIELSEN L B. The signal peptide anchors apolipoprotein M in plasma lipoproteins and prevents rapid clearance of apolipoprotein M from plasma[J]. J Biol Chem, 2008, 283: 18765-18772. DOI:10.1074/jbc.M800695200 |
| [19] |
韩秀杰, 贾建平. 中国北方汉族人群中载脂蛋白M基因多态性分布特征及连锁不平衡分析[J]. 中华医学遗传学杂志, 2007, 24: 350-353. DOI:10.3760/j.issn:1003-9406.2007.03.027 |