2018, Vol. 39
瑞香狼毒为瑞香科植物瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）的干燥根，主要分布于我国东北、河北、内蒙古、甘肃、青海、宁夏、西藏等地区。瑞香狼毒作为传统的中药材具有杀菌、杀虫、散结、逐水祛痰、止溃疡、抗病毒等多种功效[1-6]。现代药理学研究发现瑞香狼毒有较强的抗肿瘤作用[7-11]。瑞香狼毒水提取物能增强肺癌耐药细胞株对顺铂的敏感性，对肺癌耐药具有一定的逆转作用[12]。瑞香狼毒醇提物体外抗肿瘤作用研究显示，其对肝癌细胞和肺癌细胞均具有抑制作用[13-15]。瑞香狼毒黄酮类成分是其发挥抗肿瘤作用的有效成分之一，同时也是瑞香狼毒的有毒成分[16-17]。在我们的前期研究中确定了乙酸乙酯部位是瑞香狼毒的毒性部位，并鉴别出12种化合物[18-19]。目前对瑞香狼毒药理、毒理和化学成分研究的报道较多，但对其含量测定研究[20-22]鲜有报道，尚未见同时测定多种黄酮类成分的报道。本研究采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）法同时测定瑞香狼毒中狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A 5种黄酮类成分的含量。
1 仪器和材料 1.1 仪器Agilent 1100系列HPLC仪（美国Agilent公司），包括真空脱气机（G1379A型）、四元泵（G1311A型）、高性能自动进样器（G1367A型）、柱温箱（G1316A型）、二极管阵列检测器（diode array detector，DAD；G1315B型）；AE240型1/10万电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW80A型漩涡混合器（上海医科大学仪器厂）；DFY-200型高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；SB3200-T型超声波清洗器[必能信超声（上海）有限公司]。
1.2 试剂瑞香狼毒药材购自安徽亳州（产地：内蒙古，批号分别为20140214、20161001、20161101）；狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A化学对照品（纯度＞98.0%）均购自武汉中标科技有限公司；乙腈和甲酸为色谱纯；实验中使用的水由PW型超纯水系统（力康生物医疗科技控股有限公司）制备。
2 方法和结果 2.1 混合对照品溶液的制备分别取狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A对照品18.72、20.16、18.92、22.08及19.48 mg，精密称定，加甲醇稀释并定容至10 mL量瓶中，得到浓度分别为1.872、2.016、1.892、2.208及1.948 mg/mL的各对照品溶液，作为储备液。分别精密量取狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A储备液2.5、1.0、2.0、2.5、0.5 mL混合，加甲醇定容至10 mL，作为混合对照品溶液，备用。
2.2 供试品溶液的制备取瑞香狼毒干燥根适量，用粉碎机粉碎，过60目筛。取约0.5 g粉末，精密称定，置于锥形瓶中，加入20 mL甲醇，超声处理30 min，过滤，再用20 mL甲醇同法提取一次。合并2次提取得到的滤液，混合，经0.22 μm有机滤膜过滤，取续滤液1 mL转移至进样瓶中作为样品。
2.3 色谱条件色谱柱Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈，洗脱梯度为0~6 min 20% B、6~10 min 20%~35% B、10~50 min 35% B；流速为0.4 mL/min；柱后平衡时间10 min；采集时间为50 min；柱温为25 ℃；DAD检测波长为290 nm；进样量为5 μL。
2.4 方法学考察 2.4.1 系统适用性试验取狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A混合对照品溶液及供试品溶液，按2.3项色谱条件进样分析，色谱图如图 1所示。结果狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的保留时间分别为20.69、22.90、27.58、34.91和45.79 min。在供试品中其所得色谱峰峰形对称，可与其他色谱峰分离，且分离度均＞1.5。理论塔板数均＞3 000，系统适用性良好。
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图 1 混合对照品（A）及供试品（B）色谱图 Fig 1 Chromatogram of mixed control sample (A) and test sample (B) 1: Chamaechromone; 2: Neochamaejasmin A; 3: Chamaejasmine; 4: Isochamaejasmin; 5: 7-Methoxylneochaejasmin A |
2.4.2 线性关系考察
按照逐级稀释法配制标准曲线溶液，并以甲醇定容。得狼毒色原酮浓度分别为4.680、18.72、46.80、93.60、187.2、468.0 μg/mL；新狼毒素A的浓度分别为2.016、8.064、20.16、40.32、80.64、201.6 μg/mL；狼毒素的浓度分别为3.784、15.136、37.84、75.68、151.36、378.4 μg/mL；异狼毒素的浓度分别为5.520、22.08、55.2、110.4、220.8、552.0 μg/mL；7-甲氧基新狼毒素A的浓度分别为0.974，3.896，9.74，19.48，38.96，97.40 μg/mL。进样量为5 μL，按2.3项色谱条件测定。以浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，得狼毒色原酮的线性方程为y＝30.741x+11.745，r＝0.999 7，线性范围4.680~468.0 μg/mL；新狼毒素A的线性方程为y＝29.544x-60.83，r＝0.999 3，线性范围2.016~201.6 μg/mL；狼毒素的线性方程为y＝45.53x-91.777，r＝0.999 8，线性范围3.784~378.4 μg/mL；异狼毒素的线性方程为y＝27.463x-96.934，r＝0.999 3，线性范围5.520~552.0 μg/mL；7-甲氧基新狼毒素A的线性方程为y＝31.011x-15.399，r＝0.999 9，线性范围0.974~97.40 μg/mL。结果表明各对照品在线性范围内呈良好的线性关系。
2.4.3 精密度考察取混合对照品高（狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的浓度分别为468.0、201.6、378.4、552.0、97.40 μg/mL）、中（浓度分别为93.60、40.32、75.68、110.4、19.48 μg/mL）、低（浓度分别为18.72、8.064、15.136、22.08、3.896 μg/mL）3个浓度，按照2.3项色谱条件进行样品采集，1 d内进样3次考察其日内精密度；3 d内每天进样1次，考察其日间精密度。结果显示狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A在高浓度下的日内精密度分别为0.71%、0.91%、0.77%、0.84%、0.77%，在中浓度下的日内精密度分别为0.25%、0.35%、0.28%、0.40%、0.11%，在低浓度下的日内精密度分别为1.00%、0.95%、0.93%、0.86%、0.87%。狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A在高浓度下的日间精密度分别为1.41%、1.45%、1.41%、1.41%、1.43%，在中浓度下的日间精密度分别为1.60%、1.60%、1.62%、1.61%、1.62%，在低浓度下的日间精密度分别为1.13%、1.33%、1.29%、1.28%、1.45%。5种对照品在高、中、低3个浓度下的日内、日间精密度均＜2%，表明该方法精密度良好。
2.4.4 检测限与定量限按照《中华人民共和国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则项下检测限与定量限中信噪比法[23]确定5种对照品的检测限与定量限。狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的定量限（信噪比10︰1）分别为0.468、0.504、0.3784、0.552及0.487 μg/mL，检测限（信噪比3︰1）分别为0.234、0.252、0.189、0.276及0.243 μg/mL。
2.4.5 稳定性考察按照2.2项供试品溶液的制备方法制备瑞香狼毒样品（批号20161001）1份，在样品放置0、2、4、6、8、10、12 h后按照2.3项色谱条件各进样1次。计算狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.37%、1.71%、1.54%、1.62%、1.13%，均小于2%，表明样品在12 h内的稳定性良好。
2.4.6 重复性考察取瑞香狼毒药材（批号20161001）适量粉碎，过60目筛，取约0.5 g粉末，精密称定，按照2.2项供试品溶液的制备方法平行操作6份，按照2.3项色谱条件进行样品采集。计算狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的含量分别为14 787.08、2 378.03、3 182.21、3 576.37、371.35 μg/g，RSD分别为1.49%、1.35%、1.73%、1.13%、1.66%，表明该方法用于测定瑞香狼毒中这5种成分含量的重复性良好。
2.4.7 加样回收率试验取瑞香狼毒药材（批号20161001）适量粉碎，过60目筛，取粉末约0.25 g，精密称定并置于锥形瓶中，再分别加入狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A储备液1.9、0.3、0.4、0.4、0.05 mL。第1次超声提取时加入适量甲醇，使液体的总体积为20 mL。其余步骤按照2.2项方法操作，制备供试品溶液，平行操作6份。按照2.3项色谱条件进行测定，计算回收率。狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的平均加样回收率分别为97.38%、101.91%、95.62%、102.53%、98.85%，RSD分别为2.80%、4.80%、3.99%、3.53%、4.36%。
2.5 样品测定分别取3个不同批号的瑞香狼毒药材适量，粉碎，过60目筛，取粉末约0.5 g，精密称定，按2.2项方法平行配制供试品溶液各6份，按照2.3项色谱条件进样测定，根据线性回归方程计算样品中狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的含量。批号为20140214、20161001、20161101样品中狼毒色原酮的含量分别为（2 354.03±52.42）、（14 182.61±199.39）、（15 425.41±476.32）μg/g，新狼毒素A的含量分别为（738.90±15.92）、（2 281.44±67.77）、（2 344.30±69.21）μg/g，狼毒素的含量分别为（844.02±23.33）、（3 062.54±81.49）、（13 953.41±331.29）μg/g，异狼毒素的含量分别为（1 680.63±49.47）、（3 435.90±71.60）、（12 606.15±342.54）μg/g。批号为20161001、20161101样品中7-甲氧基新狼毒素A的含量分别为（363.19±8.12）和（219.45±6.42）μg/g，批号为20140214样品中7-甲氧基新狼毒素A的含量低于定量限。
3 讨论本研究在选择波长时，采用DAD对5种对照品在200~400 nm范围内的紫外吸收进行全扫描。结果发现各对照品在210 nm和290 nm波长处均具有良好的吸收，考虑到在290 nm波长处的紫外吸收干扰因素少，故以290 nm作为检测波长。
本研究在选择流动相时，分别采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水等流动相系统进行梯度洗脱实验。为了考察该方法的耐用性，分别对流速、流动相甲酸含量及柱温3个因素进行考察。流速分别设置为0.30、0.40、0.50 mL/min；流动相A甲酸的含量分别为0.1%、0.25%、0.5%；柱温分别设置为20、25、30 ℃。结果狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A的峰面积RSD均＜10%，各成分基线分离。综合考虑5种对照品的色谱图的峰形、分离度、保留时间等因素，最终选择乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱。
选择色谱柱时，在Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）等色谱柱上进行样品分离，结果发现瑞香狼毒的5种成分在Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）色谱柱上分离良好，保留时间适中。狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A在该条件的理论塔板数均＞3 000，分离度均＞1.5，各成分基线分离，不受其他色谱峰的干扰。
本研究建立了一种能同时测定瑞香狼毒药材中狼毒色原酮、新狼毒素A、狼毒素、异狼毒素和7-甲氧基新狼毒素A含量的HPLC-DAD方法。方法学考察结果表明该方法精密度高、重复性好，结果准确可靠，可用于瑞香狼毒中5种黄酮类成分的含量测定及瑞香狼毒药材的质量控制。
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