单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-1）是一种普遍存在的嗜神经DNA病毒，可以潜伏在宿主神经元中并激活引起病变，最终导致细胞死亡。阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种以认知障碍、记忆损伤为主要临床表现的进行性神经退行性疾病，脑内大量β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）积聚形成的老年斑和细胞内tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结为AD的主要病理特征。流行病学调查显示，HSV-1感染可能会加重AD的病理学进程，增加HSV-1携带者患AD的风险^[1]。在AD患者的大脑中，90%的老年斑附近存在HSV-1 DNA，72%的老年斑与其病毒DNA有关^[2]。Aβ与HSV-1的糖蛋白gB具有一定的同源序列，研究认为，HSV-1感染可以诱导细胞内Aβ生成^[3-4]，HSV-1蛋白或可作为淀粉样斑块沉积中的补充剂促进Aβ的沉积^[5]。但也有研究认为Aβ在对抗HSV-1感染中呈现保护作用^[6]。

AD患者脑内大量HSV-1 DNA与载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因密切相关，ApoE和HSV-1可能在细胞表面存在交互作用。ApoE和HSV-1在与受体结合进入细胞时，都要先与细胞表面硫酸类肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG）分子结合，即HSV-1会与ApoE竞争细胞表面的HSPG分子，而不同基因型ApoE的蛋白结构和分子结合力等不同，从而产生一定的差异^[7]。本研究通过检测HSV-1感染SH-SY5Y细胞12、24 h后相关蛋白的表达，探讨HSV-1感染与AD发病可能的联系。

非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）、SH-SY5Y细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，HSV-1由同济大学附属第十人民医院王平教授馈赠。胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、DMEM培养基、DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素双抗购自美国Gibco公司。抗ApoE抗体（ab7620）、兔抗神经元核抗原（NeuN）抗体（ab177487）、鼠抗HSV-1糖蛋白gC抗体购自英国Abcam公司；鼠抗NeuN抗体（MAB377，1:200）购自美国Merck公司；鼠抗Aβ₄₂淀粉样蛋白抗体（MOAB-2；NBP2-13075，1:250）购自美国Novus公司；兔抗淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）抗体（21204）购自英国SAB公司；兔抗磷酸化糖原合成酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）抗体购自美国CST公司；Alexa Fluor 594标记的抗鼠免疫球蛋白G、Alexa Fluor 488标记的抗兔免疫球蛋白G、Alexa Fluor 488标记的抗羊免疫球蛋白G荧光二抗购自美国Invitrogen公司；糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）、内参β-肌动蛋白（β-actin）及相应二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司。化学发光显色试剂盒购自美国Millipore公司。

Vero细胞用含10% FBS的DMEM培养液，SH-SY5Y细胞用含1%青霉素-链霉素双抗、10% FBS的DMEM/F12培养液，均置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中常规培养，待细胞长满，弃掉培养液，用0.25%胰酶消化细胞，1:3传代培养。

待Vero细胞长至80%左右时弃掉培养液，加入100 μL HSV-1悬液[5×10⁵空斑形成单位（plaque forming unit，PFU）/mL]和适量无血清培养液于培养箱中孵育1 h，每隔20 min晃动培养液以使病毒充分接触细胞。1 h后弃掉病毒悬液，加入含3% FBS的维持液培养48 h，待细胞出现大量的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）后收集上清液。重复上述步骤扩增3次病毒，于-80 ℃冰箱反复冻融3次，以便充分裂解，300×g离心5 min，取上清液分装保存。于96孔板中进行HSV-1滴度测定，测得滴度为3.2×10⁸ PFU/mL。

取SH-SY5Y细胞分为4组：以滴度为3.2×10⁸ PFU/mL的HSV-1感染SH-SY5Y细胞，感染复数（multiplicity of infection，MOI）分别设为1、10、20，即为1 MOI组、10 MOI组、20 MOI组，同时设磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）对照组。取处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，消化后重悬，分别以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于多聚赖氨酸包被的24孔板、每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中常规培养。24 h后弃掉培养液，用无血清培养液转入1、10、20 MOI HSV-1悬液，感染1 h后弃掉病毒悬液，加入含3% FBS的维持液分别培养12、24 h后行后续实验，每组设置3个复孔。显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态变化。取细胞培养上清液，行PCR鉴定细胞外液中HSV-1 DNA的表达。HSV-1DNA上游引物：5′-TGG GAC ACA TGC CTT CTT GG-3′，下游引物：5′-ACC CTT AGT CAG ACT CTG TTA CTT ACC C-3′；扩增产物长度为147 bp。

按1.4项下方法用10 MOI HSV-1感染SH-SY5Y细胞，设PBS对照组。12、24 h后取出24孔板，弃去培养液，PBS洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100（PBS配制）透膜15 min，PBS洗3次。加入10%山羊血清于室温中封闭1 h，回收封闭液，加入一抗4 ℃冰箱孵育过夜。回收一抗，PBST洗3次，加入荧光二抗室温孵育2 h。回收二抗，PBST洗3次，加入DAPI染色液孵育5 min，PBST洗3次，用抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下拍照记录。所有免疫荧光染色图像的获得采用统一的设置和曝光时间，将其转换为8字节的图片，每组随机选取至少10张图片，选择统一的感兴趣区域应用ImageJ软件分析其染色光密度。

按1.4项下方法用10 MOI HSV-1感染SH-SY5Y细胞，设PBS对照组，用RIPA裂解液裂解提取感染12、24 h后的SH-SY5Y细胞总蛋白，采用BCA法测定总蛋白浓度。上样量为每孔30 μg，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜到聚偏氟乙烯膜上，加入5%牛血清白蛋白室温封闭1 h。加入一抗4 ℃孵育过夜，回收一抗，TBST洗3次，每次10 min；加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育2 h。TBST洗3次，化学发光液显影，并使用ImageJ软件进行灰度分析。

应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。所有数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。

由图 1可见，HSV-1分别感染SH-SY5Y细胞12、24 h后，HSV-1为10 MOI时细胞中HSV-1 DNA已显著表达。因此，选用10 MOI HSV-1行后续实验。

图 1 感染HSV-1后细胞上清中HSV-1 DNA表达 Fig 1 Expression of HSV-1 DNA in supernatants HSV-1: Herpes simplex virusⅠ; M: Marker; MOI : Multiplicity of infection

10 MOI的HSV-1感染SH-SY5Y细胞12 h后，镜下可见细胞神经突起开始减少，且出现神经突起回缩；感染24 h后很少有明显的神经突起存在，且细胞开始聚集，呈圆形，并有细胞脱落。见图 2。

图 2 10 MOI HSV-1感染后SH-SY5Y细胞的形态改变 Fig 2 HSV-1 (10 MOI) infection inducing morphological changes in SH-SY5Y cells MOI: Multiplicity of infection; HSV-1: Herpes simplex virusⅠ. Original magnification: ×200

10 MOI的HSV-1感染12 h后，免疫荧光染色可观察到明显的Aβ阳性染色（图 3A），且与对照组相比，HSV-1感染组细胞中Aβ的表达增加（P＜0.01，图 3C）。HSV-1感染24 h后Aβ阳性染色主要集中于细胞内（图 3B），Aβ表达较12 h时有所下降（P＜0.01），但仍较对照组高（P＜0.05，图 3C）。

图 3 10 MOI HSV-1感染对SH-SY5Y细胞Aβ表达的影响 Fig 3 Effect of HSV-1 (10 MOI) infection on Aβ expression in SH-SY5Y cells A: Expression of Aβ in SH-SY5Y cells on 12 h of post-infection; B: Expression of Aβ in SH-SY5Y cells on 24 h of post-infection; C: Statistical analysis of immuno-intensity of Aβ in control and HSV-1 infected group. HSV-1: Herpes simplex virusⅠ; Aβ: β-Amyloid; MOI: Multiplicity of infection; NeuN: Neuronal nuclei; DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole. Original magnification: ×400 (A, B). *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group at the same time point; △△P < 0.01 vs HSV-1 group at 12 h. n=3, x±s

10 MOI的HSV-1感染12 h后，SH-SY5Y细胞中ApoE蛋白的表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；感染24 h后，ApoE蛋白的表达增加（P＜0.01），见图 4A~4C。免疫荧光染色结果（图 4D）显示，HSV-1 gC蛋白和ApoE蛋白主要聚集在细胞核周围，两者免疫荧光共染提示其可能相互作用，影响HSV-1感染诱导Aβ的表达。

图 4 10 MOI HSV-1感染对SH-SY5Y细胞ApoE表达的影响 Fig 4 Effect of HSV-1 (10 MOI) infection on ApoE expression in SH-SY5Y cells A: Expression of ApoE in SH-SY5Y cells 12 h post-infection; B: Expression of ApoE in SH-SY5Y cells 24 h post-infection; C: Statistical analysis of immuno-intensity of ApoE in control and HSV-1 infected group; D: HSV-1 gC co-localized with ApoE protein in perinuclear after HSV-1 infection. HSV-1: Herpes simplex virusⅠ; ApoE: Apolipoprotein E; MOI: Multiplicity of infection; NeuN: Neuronal nuclei; DAPI: 4', 6-diamidino-2-phenylindole. Original magnification: ×400 (A, B, D). **P < 0.01 vs control group at the same time point. n=3, x±s

蛋白质印迹结果（图 5）显示，与对照组相比，HSV-1感染12 h后细胞中APP蛋白的表达水平降低（P＜0.05），GSK-3β总蛋白的表达水平增加（P＜0.05）且Ser9位磷酸化活性增强（P＜0.05），MME蛋白的表达水平增加（P＜0.01）；感染24 h后细胞中MME蛋白的表达水平降低（P＜0.05），ApoE蛋白的表达水平增加（P＜0.05）。

图 5 HSV-1对APP、GSK-3β、p-GSK-3β、MME、ApoE表达的影响 Fig 5 Effect of HSV-1 infection on expressions of APP, MME, ApoE, GSK-3β and p-GSK-3β in SH-SY5Y cells HSV-1: Herpes simplex virusⅠ; APP: Amyloid precursor protein; GSK-3β: Glycogen synthase kinase-3β; p-GSK-3β: Phosphorylated glycogen synthase kinase-3β; MME: Melanin metabolic enzyme; ApoE: Apolipoprotein E. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group at the same time point. n=3, x±s

HSV-1为嗜神经性DNA病毒，可在中枢神经系统中建立潜伏感染，其激活导致神经病变，且可在免疫低下等情况下复发。有研究发现，HSV-1感染与AD的发生和发展密切相关，其可以增加病毒携带者患病的风险^[8]。目前关于HSV-1与神经元的体外研究主要集中于鼠原代神经元和全能干细胞，本实验选用SH-SY5Y细胞是因为该细胞可以模拟神经元，与神经元在生物学和功能特征上有许多相似性，相对于原代神经元可重复性好，且对于培养条件要求更简单^[9]。

HSV-1侵染细胞的过程复杂。病毒包膜上含有多种糖蛋白，糖蛋白gB、gC、gD、gH、gL均参与病毒对细胞的侵染。gB和gC蛋白可以介导病毒与细胞表面的硫酸类肝素蛋白多糖分子结合，从而促进gD蛋白与细胞表面的特异性受体结合，进而触发病毒包膜与细胞膜融合，促进病毒进入细胞^[10]。

研究发现，AD患者的大脑中HSV-1主要分布于Aβ斑块附近^[11]，且HSV-1 gB蛋白与Aβ有一定的同源性，这提示HSV-1可能影响脑内Aβ的水平。大脑内Aβ水平的调节主要有Aβ生成和降解两条途径。细胞合成的APP若被β-分泌酶和α-分泌酶连续切割形成Aβ肽分泌到细胞外，一般认为不会对细胞造成太大损伤；但经过β-分泌酶和γ-分泌酶的连续切割，则会生成Aβ₄₀或Aβ₄₂的片段，而Aβ₄₂片段更易造成Aβ寡聚体的形成，促进Aβ聚集进而产生细胞毒性。MME可以降解脑内错误折叠以及缠结的Aβ肽。

本研究发现HSV-1感染SH-SY5Y细胞12 h后Aβ蛋白表达明显增加，而APP蛋白的表达降低，同时ApoE蛋白的表达无明显改变。但感染24 h后，APP蛋白表达无明显改变，而ApoE蛋白表达增加；Aβ蛋白表达较对照组虽有所增加，但相较12 h时却下降。本研究中采用的MOAB2为特异性针对Aβ的1~4位氨基酸残基的抗体^[12]，而HSV-1gB蛋白与Aβ₄₂的同源性位置为22~42位氨基酸^[3]，因此Aβ表达的增加并不是由于其与HSV-1存在交叉反应。这提示Aβ表达升高可能与HSV-1感染、ApoE蛋白表达有关。

以往研究发现，HSV-1感染神经元后一方面会诱导APP发生剪切，导致Aβ和其他神经毒性片段在神经元内外累积^[13-14]，其产生的羧基端APP可以改变HSV-1进入神经元的方式，调控脑啡肽酶和GSK-3β的转录，参与Aβ级联反应；另一方面，HSV-1可以活化GSK-3依赖性通路进而上调神经元内Aβ的表达^[15]。APP为一种跨膜蛋白，GSK-3β可以干预APP的裂解过程，诱导淀粉样途径的进行，从而促进Aβ的生成。本研究发现HSV-1感染12 h后APP蛋白的表达降低（P＜0.05），表明HSV-1在感染12 h时通过影响APP的代谢过程进而影响Aβ产生，而Aβ的增多可以反馈增加MME的表达。GSK-3β磷酸化增强，活性下降，从而促进病毒通过微管网络进行蔓延^[16-17]。感染24 h时APP、GSK-3β蛋白的表达均无明显变化，MME蛋白表达降低，提示此时HSV-1主要是影响其降解过程而促进Aβ增加，此时ApoE蛋白表达增加，可与HSV-1竞争表面受体，减少HSV-1进入细胞，从而导致Aβ的表达弱于感染12 h时。

总之，本研究表明HSV-1感染可以诱导SH-SY5Y细胞Aβ表达增加，感染12 h时Aβ表达增加与促进APP蛋白代谢密切相关，可能是通过影响GSK-3β的活化从而增加Aβ表达；感染24 h时HSV-1可能主要是抑制其降解过程进而增加Aβ的表达，此时ApoE蛋白表达增强，其可能与HSV-1竞争细胞表面受体，减少HSV-1进入细胞发挥作用，导致Aβ表达弱于感染12 h时。这为进一步阐明HSV-1参与AD发病的观点提供了证据，其分子机制仍需进一步实验验证。