水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是细胞膜转运水的特异性通道蛋白，在维持机体水平衡中具有重要作用，与一系列水平衡紊乱所造成的疾病密切相关^[1]。本课题组在前期研究中发现施万细胞主要表达AQP1，且细胞的水肿形成与AQP1的表达呈正相关^[2-3]。进一步研究AQP1的表达调控机制时发现低浓度乙酰唑胺（acetazolamide，AZA）能抑制施万细胞中AQP1的表达^[4]，提示其对AQP1有负性调节作用，但相关机制尚无深入报道。

细胞骨架及其相关蛋白在对AQPs的调节中，特别是在穿梭机制调节中的作用研究越来越深入。有研究发现AZA在人胚肾细胞HEK293中通过与肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）相互作用抑制AQPs的表达，证实细胞骨架蛋白参与AQPs在短期调节机制中的调节作用^[5-6]。本课题组利用免疫沉淀及蛋白质谱分析技术在施万细胞中筛选出目的分子肌球蛋白重链14（myosin heavy chain 14，MYH14）。MYH14基因是细胞骨架蛋白家族成员，基于肌动蛋白的动力发挥作用，提示其可能参与了AQP1在穿梭机制中的调节作用。本研究通过构建MYH14特异性短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒载体下调MYH14的表达，为后续验证MYH14对施万细胞中AQP1的表达调控作用奠定实验基础。

大鼠施万细胞RSC96细胞株购自中国科学院细胞库。鼠抗MYH14多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，鼠抗GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，CCK-8细胞活力检测试剂购自东仁化学科技（上海）有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、DMEM培养液购自美国Gibco公司，青、链霉素双抗购自美国HyClone公司，Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司，GeneRuler DNA Ladder、T₄ DNA连接酶购自美国Thermo公司，NormalRun^TM 250 bp-ⅡDNA Ladder、引物购自上海捷瑞生物工程有限公司，真核表达GV298载体（AgeⅠ/BamHⅠ酶切）、TOP10感受态细胞购自上海吉凯基因化学技术有限公司，限制性核酸内切酶购自美国NEB公司，高产量Taq聚合酶（Taq Plus DNA polymerase）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）获取3个大鼠MYH14 mRNA（NM-001100690）的靶点序列，分别为MYH14-shRNA1、MYH14-shRNA2和MYH14-shRNA3。选取无关序列（scramble序列）作为阴性对照序列（negative control shRNA，NC-shRNA），经Blast序列比对显示其与大鼠已知基因均无明显同源性，具体序列见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 MYH14-shRNA的序列信息 Tab 1 MYH14-shRNA sequences Target Species Sequence (5′-3′) GC content (%) MYH14-shRNA1 Rat GGG AGC AAA CAT CGA GAC CTA 52.38 MYH14-shRNA2 Rat GAC CAC AGA GGC CAA GAT GAA 52.38 MYH14-shRNA3 Rat GAG GAG AAG GCT GCA GTG CTA 57.14 NC-shRNA (scramble sequence) TTC TCC GAA CGT GTC ACG T MYH14: Myosin heavy chain 14; shRNA: Short hairpin RNA; NC: Negative control

表 1 MYH14-shRNA的序列信息 Tab 1 MYH14-shRNA sequences

使用AgeⅠ/BamHⅠ限制性内切酶对真核表达载体GV298进行双酶切使其线性化，将由shRNA反转录合成的DNA（表 2）溶解于退火液中梯度退火。取线性化载体100 ng、双链DNA 100 ng、10×T₄ DNA连接酶缓冲液2 μL、T₄ DNA连接酶1 μL，加入双蒸水至总体系20 μL，16 ℃静置过夜合成连接产物。取10 μL产物加入到100 μL感受态细胞中，冰上放置30 min；42 ℃激活90 s，冰浴2 min；加入500 µL LB培养液，37 ℃摇床振荡培养1 h；取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，恒温培养箱中倒置培养12~16 h。

表 2 (Tab 2)

表 2 MYH14-shRNA的DNA序列 Tab 2 DNA sequences of MYH14-shRNA Gene Sequence (5′-3′) MYH14-shRNA1 CCG GGG GAG CAA ACA TCG AGA CCT ACT CGA GTA GGT CTC GAT GTT TGC TCC CTT TTT G GAT CCA AAA AGG GAG CAA ACA TCG AGA CCT ACT CGA GTA GGT CTC GAT GTT TGC TCC C MYH14-shRNA2 CCG GGA CCA CAG AGG CCA AGA TGA ACT CGA GTT CAT CTT GGC CTC TGT GGT CTT TTT G GAT CCA AAA AGA CCA CAG AGG CCA AGA TGA ACT CGA GTT CAT CTT GGC CTC TGT GGT C MYH14-shRNA3 CCG GGA GGA GAA GGC TGC AGT GCT ACT CGA GTA GCA CTG CAG CCT TCT CCT CTT TTT G GAT CCA AAA AGA GGA GAA GGC TGC AGT GCT ACT CGA GTA GCA CTG CAG CCT TCT CCT C

表 2 MYH14-shRNA的DNA序列 Tab 2 DNA sequences of MYH14-shRNA

设计引物序列（表 3），配制PCR反应体系（双蒸水9.2 μL，2×Taq Plus MasterMix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL），振荡混匀，短暂离心。在超净台中用无菌枪头挑取单个菌落至20 µL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中测定。将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量LB培养液中，37 ℃培养12~16 h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析，并抽提阳性克隆质粒转染细胞。

表 3 (Tab 3)

表 3 引物序列 Tab 3 Primer sequences Gene Sequence (5′-3′) MYH14-shRNA1 F: GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT R: ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G MYH14-shRNA2 F: GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT R: ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G MYH14-shRNA3 F: GCC CCG GTT AAT TTG CAT AT R: ATG TCC TTC TGC TGA TAC TGG G

表 3 引物序列 Tab 3 Primer sequences

取测序正确的菌液于15 mL含氨苄西林的LB培养液中37 ℃培养过夜，收集菌液于15 mL离心管中，1 000×g离心2 min，弃上清，加入250 μL细胞重悬液，充分振荡使菌块悬浮均匀；加入250 μL细胞裂解液和10 μL蛋白酶K，轻轻混匀，静置1~2 min使菌体裂解澄清；加入350 μL中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5 min；14 000×g离心10 min，弃蛋白，收集上清于另一无菌1.5 mL离心管中；12 000×g离心5 min，将上清转移至回收柱中，13 000×g离心1 min，弃下层废液；加入600 μL预先配制的漂洗液，13 000×g离心1 min，弃下层废液，重复1次，13 000×g空离2 min，除去残留的漂洗液；将回收柱转移至新的1.5 mL离心管中，静置10~20 min，自然晾干；加入95 μL无核酸酶水，静置2 min，13 000×g离心2 min，收集质粒测定浓度并进行质量检查。

取RSC96细胞以1×10⁵/mL的密度贴壁培养于6孔板中，待细胞融合达50%~60%时更换为无血清培养液。在无菌离心管中配制工作液，A液：opti-MEM 125 μL、Lipofectamine 3000 7.5 μL；B液：shRNA质粒2.5 μg、opti-MEM 125 μL、P300反应物5 μL；将A、B液混匀后室温孵育15 min，加入到6孔板中转染细胞，在细胞培养箱中培养，于荧光显微镜下观察各时间点（24、28和72 h）的细胞转染情况。

转染后培养72 h收集细胞，PBS洗涤，加入裂解液于冰上裂解30 min；4 ℃下12 000×g离心20 min取上清液，BCA法测定蛋白质量浓度。调整蛋白质量浓度为5 μg/μL，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水变性5 min；按照蛋白质印迹操作程序电泳、转膜、封闭，一抗孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜后加入化学发光试剂显影、定影，使用ImageJ软件对各蛋白条带进行定量分析。

设置空白组、对照组、阴性对照组、MYH14-shRNA组，空白组为不含细胞的DMEM培养液，对照组为未转染的RSC96细胞，阴性对照组和MYH14-shRNA组分别为转染NC-shRNA和MYH14-shRNA2后的细胞。将细胞悬液以1×10⁴/孔的密度接种于96孔板中，贴壁培养24 h后用PBS漂洗，各孔更换为新鲜配制的含10 μL CCK-8的无血清DMEM培养液，继续孵育1.5 h。用酶标仪测定450 nm下各孔的光密度（D）值，计算细胞活力。细胞活力（%）=（处理组－空白组）/（阴性对照组－空白组）×100%。

采用SPSS 18.0软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，两组间均数的比较采用两独立样本t检验，多组间均数的比较采用单因素方差分析。检验水准（α）为0.05。

设计引物时，引物两端分别带有AgeⅠ、BamHⅠ酶切位点，双酶切后，通过T₄ DNA连接酶等构建成慢病毒，经琼脂糖凝胶电泳观察可见条带与预计结果相符，目的基因插入慢病毒表达载体内（图 1）。重组质粒测序结果显示，MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2的序列正确，MYH14-shRNA3测序中断。

图 1 MYH14-shRNA的PCR琼脂糖凝胶电泳图 Fig 1 PCR gel electrophoregram of MYH14-shRNA clone A: MYH14-shRNA1; B: MYH14-shRNA2; C: MYH14-shRNA3. 1: Negative control (ddH2O); 2: No load self-attached control; 3: Marker; 4-8: MYH14-shRNA (the positive cloned PCR fragment ligated into the shRNA fragment was 499 bp, and the empty vector cloned PCR fragment without attachment to shRNA fragment was 450 bp). MYH14: Myosin heavy chain 14; shRNA: Short hairpin RNA; PCR: Polymerase chain reaction

分别使用NC-shRNA、MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2质粒转染RSC96细胞不同时间后，荧光显微镜下观察转染细胞的荧光表达情况，结果（图 2）可见各组质粒转染细胞后的荧光强度随时间增加逐渐增强，至72 h时最强，故采用转染72 h的细胞进行后续实验。

图 2 MYH14-shRNA转染后不同时间点大鼠施万细胞RSC96的免疫荧光检测结果 Fig 2 Immunofluorescence of rat Schwann cells RSC96 at different time points after MYH14-shRNA transfection MYH14: Myosin heavy chain 14; shRNA: Short hairpin RNA; NC: Negative control. Original magnification: ×20

与阴性对照组相比，MYH14-shRNA1组的MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），而MYH14-shRNA2组的MYH14蛋白表达水平降低（0.57±0.15 vs 1.11±0.06，P＜0.01），见图 3。故使用MYH14-shRNA2质粒进行后续实验。

图 3 MYH14-shRNA2转染下调大鼠施万细胞RSC96中MYH14的表达 Fig 3 MYH14-shRNA2 transfection down-regulates expression of MYH14 in rat Schwann cells RSC96 MYH14: Myosin heavy chain 14; shRNA: Short hairpin RNA; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; NC: Negative control. **P < 0.01 vs NC-shRNA group. n=3, x±s

使用MYH14-shRNA2质粒转染RSC96细胞24 h后，MYH14-shRNA2组的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义（1.09±0.16 vs 1.00±0.15，P＞0.05），提示MYH14-shRNA转染后MYH14蛋白水平降低对细胞活力无影响（图 4）。

图 4 MYH14下调对大鼠施万细胞RSC96活力的影响 Fig 4 Effect of MYH14 down-regulation on viability of rat Schwann cells RSC96 MYH14: Myosin heavy chain 14; NC: Negative control; shRNA: Short hairpin RNA. n=3, x±s

肌球蛋白家族包括17种非常规肌球蛋白和一类含有3种非肌球蛋白家族的肌球蛋白^[7]。这3种肌球蛋白主要由MYH9、MYH10和MYH14编码，分别位于22、17和19号染色体^[8-10]。MYH14基因位于19号染色体，编码肌球蛋白结合蛋白C。研究表明相比胚胎发育时期，成年人或动物组织中广泛高表达MYH14蛋白^[11]。有研究发现MYH14在人体脑、心脏、肾脏、肝脏、结肠、小肠、肺和周围神经中均有表达^{[8, 12-13]}。2004年MYH14首次被鉴定为神经性耳聋的致病基因^[14]；随后有学者证实在先天性小耳畸形疾病中MYH14基因表达亦存在异常^[15-16]，但其在周围神经系统中的作用尚未见报道。最近有研究证实MYH14编码区含有氨基末端肌球蛋白“运动”结构域，包括肌球蛋白头域、2个IQ结构域和羧基末端肌球蛋白尾域，其特殊区域对于细胞内水囊泡的运输具有重要作用，该特殊功能是否协同AQP1参与细胞内水分子的运输并作为潜在的治疗靶点值得进一步研究^[11]。本实验拟通过构建MYH14-shRNA慢病毒载体下调其表达，为验证MYH14在施万细胞中对AQP1的表达调控作用奠定基础。

RNA干扰是将mRNA编码的同源小靶片段外缘双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）导入细胞中，通过一系列细胞内反应特异性降解细胞中的mRNA，从而导致相应基因沉默，是目前研究细胞信号转导通路和基因功能的重要工具^[17-18]，具有高特异性、高效率、可遗传性、可进行多基因研究等特点^[19]。shRNA是一段具有紧密发卡环的RNA序列，外源性shRNA通过特定的载体转染入细胞后发挥特定的沉默效果，目前常被用于RNA干扰^[20]。阳离子脂质体法、电穿孔法、Biolistic颗粒传递法、慢病毒载体法等为目前常见的细胞转染方法，其转染效率不同。由于慢病毒载体既能感染分裂活跃期细胞，又能高效率感染分裂缓慢或非分裂期细胞，并可携带较大的外源性基因，且对转录沉默作用有较强的抵抗力，能长期稳定表达目的基因，不会导致寄主细胞的死亡，转染的动物细胞能连续传代，即使对于稳定转染困难的大鼠单核细胞也能高效感染^[21]，目前已成为体外和体内基因传递的有效工具^[22-23]。

本研究设计出特异性shRNA靶点，通过慢病毒载体将目的基因整合到宿主细胞染色体中，成功构建了MYH14干扰载体。通过提取质粒后再转染RSC96细胞，应用蛋白质印迹分析筛选出干扰效能最大的MYH14-shRNA，为后续实验验证MYH14对施万细胞中AQP1穿梭机制的影响和研究AQP1相关信号通路奠定了实验基础。