2018, Vol. 39
2. 保定市第一医院血液内科, 保定 071000;
3. 河北大学附属医院麻醉科, 保定 071000
, YANG Sheng-jun1, HAO Hong-ling1, WANG Su-yun1*
, WANG Hong-jie3, QI Feng2, CHENG Zhi-yong2, LIU Gui-min2
2. Department of Hematology, The First People's Hospital of Baoding, Baoding 071000, Hebei, China;
3. Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China
骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neo-plasm，MPN）是发生于血液系统的一类造血干细胞异常的克隆性疾病，其特点为骨髓中出现一系或多系异常增殖的血细胞，使血栓性疾病的发生率增加，并且增加向急性髓细胞白血病转化的风险。大部分MPN患者存在Janus激酶（Janus kinase 2，JAK2）基因突变。Kim等[1]研究了包括原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）、真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）和原发性血小板增多症（essential thrombocythemia，ET）的407例MPN患者，检测到275例（67.6%）患者具有JAK2V617F突变。该突变可导致JAK2持续激活，从而使细胞因子受体JAK/STAT信号通路活化，进一步引起细胞增殖和抑制凋亡，导致PMF、PV或ET的发生[2]。
鲁索替尼（ruxolitinib）是一种选择性的JAK1/2抑制剂，通过竞争性抑制JAK1/2激酶结构域催化亚基上ATP结合位点，对JAK激酶活性起到抑制作用。2010年，Quintás-Cardama等[3]首次报道了鲁索替尼可以通过抑制JAK1/2治疗骨髓纤维化，从而最早被批准用于治疗中危或高危骨髓纤维化。大系列的Ⅲ期临床试验，包括COMFORT-Ⅰ和COMFORT-Ⅱ，明确了鲁索替尼缩脾和改善骨髓纤维化症状的疗效，并且证实了鲁索替尼与现有的骨髓纤维化治疗药物相比，可延长骨髓纤维化患者的总体生存期[4-6]。
研究表明，JAK/STAT信号途径是多种细胞因子的转导途径，介导细胞内多种细胞因子和生长因子的信号转导过程，并且进一步活化相关靶基因，影响细胞的增殖、凋亡和分化过程[7]。JAK/STAT信号通路同时也受多种因子的调控。细胞因子信号转导抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）是JAK/STAT信号通路的反馈调控蛋白之一，能够抑制JAK/STAT信号途径的活性[8]。含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1（SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1，SHP1）也是JAK/STAT通路重要的负调控因子之一，其基因表达的减少或缺失可引起JAK/STAT信号通路的持续激活，与血液系统恶性肿瘤的发生密切相关[9]。迄今为止，鲁索替尼是否参与JAK2V617F突变细胞的SOCS1、SHP1表达调控，尚未见相关报道。因此，本研究观察了MPN患者JAK2V617F突变量和骨髓病理标本中磷酸化JAK2（phosphorylated Janus kinase 2, p-JAK2）、SOCS1、SHP1的蛋白表达情况，同时用不同浓度的鲁索替尼处理JAK2V617F突变阳性的人红白血病细胞系HEL细胞，观察其对HEL细胞活力的影响，探讨鲁索替尼是否通过JAK/STAT信号通路影响SOCS1、SHP1 mRNA和蛋白的表达，为鲁索替尼治疗MPN阐明新的作用机制。
1 材料和方法 1.1 患者资料纳入2012年7月至2016年8月于河北省人民医院和保定市第一医院就诊的48例初诊为JAK2V617F突变阳性MPN患者为MPN组，包括PV 21例、ET 14例、PMF 13例；其中男性22例、女性26例；中位年龄52（31~72）岁。所有MPN患者的诊断均符合2015年世界卫生组织（WHO）修订的MPN诊断标准[10]。对照组为同期就诊的24例贫血患者，其中男性10例、女性14例；中位年龄48（28~67）岁。本研究通过保定市第一医院医学伦理委员会批准（批准文号20120701），所有患者均签署知情同意书。
1.2 细胞与主要试剂人红白血病细胞系HEL细胞株（购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）用含10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）的RPMI 1640培养液（美国Gibco公司）培养于37 ℃、5% CO2 孵育箱。CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。JAK2（货号sc-294，批号14012）、p-JAK2（货号sc-101718，批号15002）、SOCS1（货号sc-9021，批号15001）、SHP1（货号sc-287，批号15002）单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。EnivisionTM plus试剂盒购自福州迈新生物开发有限公司。基因组RNA提取试剂购自北京博迈德生物技术有限公司。引物序列由北京赛百盛基因技术有限公司合成。鲁索替尼（货号HY50858，批号SR007）购自瑞士诺华公司。
1.3 实验方法 1.3.1 免疫组织化学染色检测组织中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白表达骨髓病理组织蜡块4 μm切片，45 ℃烤片3 h，脱蜡，抗原修复，加3%过氧化氢、磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，随后加入p-JAK2、SOCS1、SHP1一抗（均为1:100稀释）4 ℃过夜。PBS清洗3次，每次5 min，加EnivisionTM plus试剂盒中试剂A、试剂B，PBS冲洗。DAB显色，以细胞膜、细胞质或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，苏木精复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗。切片经梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封片。高倍镜视野下计数阳性细胞。
1.3.2 CCK-8试剂盒检测HEL细胞活力收集对数生长期HEL细胞，取细胞悬液100 μL（含5 000个细胞）加入到96孔板，设空白组、对照组和实验组，每组设5个平行孔。空白组加入100 μL无细胞的培养液和不同浓度（50、100、250、500、1 000 nmol/L）的鲁索替尼；对照组加入100 μL细胞悬液，不添加鲁索替尼；实验组加入100 μL细胞和不同浓度鲁索替尼。分别培养细胞至0、24、48 h时加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h后，用酶标仪测定450 nm处的光密度（D）值，计算细胞活力。细胞活力（%）＝[(D实验组－D空白组)/(D对照组－D空白组)]×100%，根据计算结果绘制细胞生长曲线，实验重复3次，取平均值。
1.3.3 qPCR法检测骨髓活检标本JAK2V617F突变量和HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1的mRNA表达收集细胞提取总RNA，检测RNA纯度，合格后反转录合成cDNA。以cDNA为模板、以β-actin 为内参基因进行qPCR反应，反应体系共25 μL，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，1个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。qPCR反应前3~15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，调节基线至适宜处作为阈值，各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为Ct值。根据公式ΔCt＝ Ct（目的基因）－Ct（内参基因）和ΔΔCt＝2－ΔCt，计算各目的基因的相对表达量，各组实验重复3次，取平均值。JAK2V617F MGB荧光探针上游引物5′-FAM-TCA CAA GCA TTT GGT TTT-MGB-3′，JAK2V617F 下游引物：5′-CCA GAA TAT TCT CGT CTC CAC TGA A-3′。根据标准品计算JAK2 和JAK2V617F 的绝对拷贝数量，计算JAK2V617F/JAK2比值。全序列引物设计见表 1。
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表 1 qPCR引物序列 Tab 1 Primer sequence for qPCR |
1.3.4 蛋白质印迹法检测HEL细胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1和SHP1的蛋白表达
收集细胞（约1×107 个），于冰上加预冷蛋白裂解液和PMSF，4 ℃裂解1 h，离心收集上清液，用考马斯亮蓝试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定样品上清液中的蛋白浓度。取适量蛋白样品加入上样缓冲液混匀，高温变性。样品经120 V恒压聚丙烯酰胺凝胶电泳后，4 ℃ 100 V恒压2 h电转移至PVDF膜，然后用5%脱脂奶粉溶液常温封闭2 h，TBST洗膜。加JAK2（1:700稀释）、p-JAK2（1:500稀释）、SHP1（1:500稀释）和SOCS1（1:500稀释）一抗，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST再次漂洗，显影、拍照，并进行灰度扫描和分析。
1.4 统计学处理应用SPSS 19.0软件行数据分析。呈正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。各变量间的相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准（α）为0.05。
2 结果 2.1 MPN患者JAK2V617F突变量和p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白的表达水平MPN组JAK2V617F/JAK2比值为（57.33±20.82）%，对照组为0%。骨髓病理组织中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白均表达于细胞质中，三者在MPN组中的表达水平与对照组相比差异均有统计学意义（P 均＜0.01）。见图 1和表 2。
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图 1 MPN组和对照组骨髓病理组织中p-JAK2、SOCS1、SHP1的表达 Fig 1 Expressions of p-JAK2, SOCS1, and SHP1 in bone marrow tissues in MPN and Con groups Con: Control; MPN: Myeloproliferative neoplasm; p-JAK2: Phosphorylated Janus kinase 2; SOCS1: Suppressor of cytokine signaling 1; SHP1: SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1. Immunohistochemical staining. Original magnification: ×400 |
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表 2 MPN组和对照组JAK2V617F突变量和p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白表达的比较 Tab 2 Comparison of JAK2V617F mutation level, and protein expressions of p-JAK2, SOCS1 and SHP1 between MPN and control groups |
2.2 JAK2V617F突变量与p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白表达量之间的关系
相关分析表明，MPN组织中SOCS1、SHP1蛋白表达量均与JAK2V617F突变量呈负相关（r＝－0.648、－0.692，P 均＜0.05）。以50%为界值，将MPN患者分为JAK2V617F/JAK2比值≥50%和＜50%两组，JAK2V617F/JAK2比值≥50%的MPN患者22例，＜50%者26例。对两组MPN患者SOCS1、SHP1蛋白表达水平进行分析，结果（表 3）表明，JAK2V617F/JAK2比值≥50%的MPN患者骨髓病理组织中SOCS1、SHP1的蛋白表达水平均低于JAK2V617F/JAK2比值＜50%者（P 均＜0.01），p-JAK2的蛋白表达水平高于JAK2V617F/JAK2比值＜50%者（P＜0.01）。
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表 3 JAK2V617F突变量与p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白表达的关系 Tab 3 Relationships between JAK2V617F mutation and protein expressions of p-JAK2, SOCS1 and SHP1 |
2.3 鲁索替尼和HEL细胞活力的量效关系
CCK-8法检测结果显示，不同浓度的鲁索替尼均可影响HEL细胞活力，并且随着鲁索替尼浓度的增加细胞活力呈逐渐降低趋势。浓度为50、100、250、500和1 000 nmol/L的鲁索替尼分别处理HEL细胞48 h后，HEL细胞活力分别为（70.14±3.21）%、（59.71±3.46）%、（52.05±2.88）%、（43.31%±2.16）%和（38.56±2.08）%。在鲁索替尼处理24 h时，HEL细胞活力较0 h时下降，250 nmol/L鲁索替尼处理HEL细胞24、48、72 h时的细胞活力分别为（60.06±3.87）%、（52.05±2.88）%、（36.43±2.01）%，表明随着鲁索替尼处理时间的延长，细胞活力逐渐降低。
2.4 不同浓度鲁索替尼对HEL细胞JAK2、SOCS1、SHP1的mRNA和蛋白以及p-JAK2蛋白表达的影响结果如图 2、表 4所示，不同浓度鲁索替尼处理HEL细胞48 h后，随着浓度的增加JAK2 mRNA表达水平逐渐降低（F＝60.84，P＜0.01），SOCS1、SHP1 mRNA表达水平逐渐升高（F＝34.20、87.23，P 均＜0.01）。不同浓度鲁索替尼处理HEL细胞48 h后，随着鲁索替尼浓度的增加，HEL细胞中JAK2、p-JAK2蛋白表达水平逐渐降低（P＜0.05，P＜0.01），SOCS1、SHP1的表达水平则逐渐升高（P 均＜0.01）。与鲁索替尼对HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1 mRNA的调控效应结果一致。
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表 4 不同浓度鲁索替尼处理后HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1的mRNA和蛋白以及p-JAK2蛋白的表达 Tab 4 Expressions of JAK2, SOCS1 and SHP1 mRNA and proteins, and p-JAK2 protein in HEL cells after treating with ruxolitinib at different concentrations |
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图 2 不同浓度鲁索替尼处理后HEL细胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白的表达 Fig 2 Expressions of JAK2, p-JAK2, SOCS1 and SHP1 proteins in HEL cells after treating with ruxolitinib at different concentrations Western blotting analysis. JAK2: Janus kinase 2; p-JAK2: Phosphorylated Janus kinase 2; SOCS1: Suppressor of cytokine signaling 1; SHP1: SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1 |
3 讨论
JAK/STAT通路参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学行为，在细胞因子受体介导的信号通路中起核心作用，是多数细胞因子的转导途径并活化相关靶基因[7, 11]。诸多研究表明，肿瘤的发生、发展与JAK/STAT信号通路的异常激活密切相关。费城染色体阴性的MPN患者中常常存在JAK2V617F、JAK2基因第12外显子突变，并且JAK2V617F 突变发生率最高[2]。JAK2V617F突变导致酪氨酸激酶过度活化从而持续激活JAK/STAT信号通路。本研究采用qPCR检测了48例MPN患者的JAK2V617F突变量，结果为（57.33±20.82）%，其中突变量≥50%的比例为45.83%（22/48），对照组的突变量则为0%。Zhao等[12]研究了中国170例PV和ET患者JAK2V617F突变量，所有患者JAK2V617F突变量中位数为15.6%，突变量＞50%的比例分别为35.2%和11.2%，低于本研究结果，分析原因，本研究检测的是JAK2突变阳性的MPN患者，而Zhao等的结果则是统计了包括JAK2V617F突变阴性的所有PV和ET患者。另外，本研究应用免疫组织化学法检测的MPN患者p-JAK2蛋白表达量为（74.01±23.19）%，对照组为（42.29±15.78）%，差异有统计学意义（P＜0.01），表明MPN患者JAK2V617F突变量和JAK2的活性均存在异常。
SOCS1不仅是JAK/STAT信号通路的靶基因，也是其负反馈调控因子，最终影响细胞的生长、增殖等生物学行为，从而抑制疾病、肿瘤的进展。SHP1是上皮和部分造血细胞恶性肿瘤的抑癌基因，是一种含SH2域的胞质酪氨酸磷酸酶，常通过JAK/STAT信号通路在造血细胞增殖分化中发挥负调控作用。多项研究表明，在乳腺癌、多发性骨髓瘤、急性髓细胞白血病等多种恶性肿瘤中发现SOCS、SHP1参与JAK/STAT的负向调节[13-16]，但在MPN患者中尚未见相关报道。因此本研究检测了MPN患者肿瘤组织中SOCS1、SHP1蛋白表达情况，发现在MPN患者中SOCS1、SHP1蛋白表达较对照组降低（P＜0.01），并且与JAK2V617F突变量呈负相关（SOCS1：r＝－0.648，SHP1：r＝－0.692；P 均＜0.01），进一步证实了MPN中SOCS1、SHP1与JAK/STAT的负向调控关系，为后续实验奠定了基础。
近期发表的Ⅲ期临床试验证实了鲁索替尼的临床疗效[17]。本课题组前期研究显示，鲁索替尼能通过抑制JAK/STAT信号通路活化，抑制MPN患者肿瘤组织和HEL细胞中p-JAK2的表达，干扰下游靶基因与基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-2、MMP-9启动基因的结合，下调MMP-2、MMP-9表达，从而抑制MMP-2、MMP-9参与的肿瘤细胞的侵袭和迁移过程，阻断了肿瘤细胞的无限增殖与迁移[18]。本研究在既往研究的基础上，进一步应用鲁索替尼处理具有JAK2V617F 突变的人红白血病细胞系HEL细胞，发现不同剂量的鲁索替尼能够抑制HEL细胞活力，影响其增殖。
一项对骨髓纤维化患者的长期临床观察的研究结果显示，经过鲁索替尼治疗后JAK2V617F突变量降低，约50%的患者纤维化程度得到改善或者病情稳定[19]。考虑到MPN患者中SOCS1、SHP1蛋白表达较对照组降低，因此，本研究还探讨了鲁索替尼是否能够通过调控JAK/STAT上调SOCS1、SHP1的表达。随着鲁索替尼浓度的增加，鲁索替尼对HEL细胞JAK2 mRNA、蛋白和p-JAK2蛋白表达的抑制作用逐渐增加，同时SOCS1、SHP1在mRNA和蛋白的表达水平均逐渐上升，表明鲁索替尼能够以SOCS1、SHP1为靶标，通过促进或阻断JAK/STAT通路达到治疗MPN的目的。
由此可见，MPN患者JAK2V617F突变细胞中SOCS1、SHP1低表达，并且与JAK2V617F突变量密切相关，鲁索替尼能够抑制JAK2V617F突变HEL细胞的增殖，并通过调控SOCS1、SHP1抑制JAK2信号通路，从而抑制MPN细胞增殖。
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