过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体通过吸入、食入、注入或接触某种含有致敏成分的物质（过敏原或变应原）后触发机体产生过量的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE），从而引起各种功能性障碍或组织损伤的一类疾病。过敏性疾病从新生儿到老年人的各个年龄阶段都可能发生，往往具有明显的遗传倾向。过敏性疾病中，速发型过敏反应比较常见，其主要类型有皮肤过敏反应、呼吸道过敏反应、消化道过敏反应和过敏性休克等，对人类健康造成了不同程度的危害，严重者甚至有生命危险。过敏性疾病是当前世界性的重大卫生学问题，全球总发病率约为15%~30%，我国约有5%~10%的人受过敏原的困扰，其已被世界卫生组织（World Health Orgnization，WHO）列为21世纪重点防治的三大疾病之一^[1-3]。

屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus，国际过敏原代码D1）和粉尘螨（Dermatophagoides farinae，国际过敏原代码D2）是常见的吸入性过敏原，能诱发哮喘、过敏性鼻炎、湿疹和结膜炎等过敏性疾病以及严重过敏反应。研究表明尘螨与哮喘等过敏性疾病密切相关^[4-6]。

尘螨过敏的诊断主要依赖免疫学检测。目前临床上有许多体内和体外的免疫学检测方法，包括尘螨变应原皮肤试验、血清尘螨特异性免疫球蛋白E（specific immunoglobulin E，sIgE）抗体测定、尘螨支气管或鼻腔激发试验、肥大细胞脱颗粒试验、嗜酸粒细胞阳离子蛋白水平测定等。尘螨过敏患者的sIgE抗体水平增高，检测sIgE抗体水平可以帮助确诊尘螨过敏及其过敏程度，同时可以作为评价临床疗效的指标^[7-10]。临床sIgE抗体定量检测技术的发展经历了20世纪60年代的放射免疫诊断技术（radioimmunoassay，RIA），目前临床多采用ELISA检测方法^[11-12]，但其检测的灵敏度和准确度远不如化学发光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）^[13]，而且CLIA克服了ELISA法非均相反应所带来的本底特异性不高的缺点。长期以来，临床可用的sIgE定量检测系统很少，采用免疫荧光法的ImmunoCAP^®系统是国际上普遍接受的过敏原检测方法^[14-15]，但该系统成本较高，在国内很难大范围推广。纳米磁微粒化学发光免疫分析法（magnetic nanoparticle chemiluminescence immunoassay，NM-CLIA）是目前国际上先进的免疫学检测技术，该技术整合了悬浮磁微粒载体包被技术和CLIA，因此具有检测范围宽、灵敏度高、特异性强、快速准确等优点^[16-17]。本研究按照美国临床实验室标准化协会标准方法，评价NM-CLIA定量检测屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体的性能。

Lumiray 1600型全自动纳米磁微粒化学发光检测平台及其配套清洗液、发光底物，屋尘螨、粉尘螨sIgE抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）及其校准品、校准品稀释液和质控品（0.7 U/mL和17.5 U/mL）均购自江苏浩欧博生物医药股份有限公司，其中屋尘螨、粉尘螨sIgE抗体检测试剂盒中包括生物素化的屋尘螨、粉尘螨过敏原，碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗和链霉亲和素标记的纳米磁微粒。屋尘螨、粉尘螨sIgE抗体免疫荧光法检测试剂及配套仪器购自美国赛默飞公司。

收集于上海交通大学医学院附属苏州九龙医院儿科、皮肤科和耳喉鼻科门诊就诊的疑似过敏患者血清样本。入选标准：年龄、性别不限，乙肝表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗体（抗-HCV抗体）、人类免疫缺陷病毒1/2抗体（抗-HIV1/2抗体）和梅毒螺旋体抗体（抗-TP抗体）均为阴性，临床症状表现为疑似屋尘螨、粉尘螨过敏（过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、过敏性皮疹、过敏性荨麻疹等）的患者。本研究通过上海交通大学医学院附属苏州九龙医院医学伦理委员会审批（批件号KY-2017-020）。

NM-CLIA通过间接法反应原理检测屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体，反应全程在Lumiray 1600型全自动纳米磁微粒化学发光检测平台上自动运行。具体反应过程如下：（1）将待测样本15 μL、链霉亲和素标记的纳米磁微粒45 μL、生物素标记的屋尘螨或粉尘螨过敏原15 μL混合，于37 ℃孵育15 min，样本中屋尘螨或粉尘螨sIgE抗体与屋尘螨或粉尘螨过敏原特异性结合，并附着在磁微粒表面，经洗涤去除多余的生物素标记的屋尘螨或粉尘螨过敏原。（2）加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗130 μL，形成固相抗原-抗体-酶标二抗复合物，经过洗涤，未被结合的酶标抗体以及其他物质被去除。（3）加入发光底物200 μL，酶标抗体上的酶催化发光底物发射光子，发光强度与样本中的sIgE抗体含量成正比。使用已知浓度的校准品校准曲线，将待测物的发光强度代入校准曲线进行拟合计算，即可得出样本中屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体的含量。

采用全点定标，人源性IgE蛋白的7个不同浓度水平的校准品为0 U/mL（S0）、0.35 U/mL（S1）、0.7 U/mL（S2）、3.5 U/mL（S3）、17.5 U/mL（S4）、50 U/mL（S5）、100 U/mL（S6）。

（1）最低检出限（limit of detection，LoD）：用校准品S0和S1作为样本进行检测，其中S0重复测定20次，S1重复测定5次，计算S0重复测定20次的浓度平均值（M）和标准差（SD），得出M+2SD，代入S0、S1的浓度和发光值的平均值拟合得出一次方程，计算得到的浓度值即为LoD。（2）稀释线性：将NM-CLIA测定值为100 U/mL的样本用校准品S0进行3倍倍比稀释，共稀释7次，最终稀释浓度≤0.35 U/mL，每个稀释样本测定3次，计算浓度值，将测定的平均浓度与理论浓度以最小二乘法线性拟合，剔除离群值后回归拟合，并对回归方程进行线性检验。（3）批内精密度（within-run precision）：选择NM-CLIA测定值为高值（＞17.5 U/mL）、中值（＞3.5 U/mL且＜10 U/mL）和低值（＜0.7 U/mL）的样本，重复测定10次，计算M和SD，再计算批内精密度[(SD/M)×100%]。（4）批间精密度（between-run precision）：选择NM-CLIA测定值为高值（＞17.5 U/mL）、中值（＞3.5 U/mL且＜10 U/mL）和低值（＜0.7 U/mL）的样本重复测定4次，每天2次，连续测定10 d，计算M及SD，再计算批间精密度[(SD/M)×100%]。

应用NM-CLIA和免疫荧光法同时检测屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体，对2种方法学进行级别符合率分析。根据cut-off值为0.35 U/mL进行判定，＜0.35 U/mL为阴性，≥0.35 U/mL为阳性。根据美国赛默飞Phadia过敏原诊断试剂分级标准进行sIgE分级：0.35 U/mL≤1级≤0.7 U/mL，0.7 U/mL＜2级≤3.5 U/mL，3.5 U/mL＜3级≤17.5 U/mL，17.5 U/mL＜4级≤50 U/mL，50 U/mL＜5级≤100 U/mL，＞100 U/mL为6级。以美国赛默飞Phadia过敏原诊断结果为标准，分别计算NM-CLIA检测的屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体阴性、阳性符合率及±1级别符合率。其中阳性符合率为Phadia阳性样本中NM-CLIA阳性例数/Phadia阳性样本数，阴性符合率为Phadia阴性样本中NM-CLIA阴性例数/Phadia阴性样本数；±1级别符合率为Phadia阳性样本中NM-CLIA测定值为阳性，同时与Phadia级别差≤±1的样本数/Phadia阳性样本数。

应用SPSS 21.0软件分别对NM-CLIA与免疫荧光法检测的屋尘螨过敏原和粉尘螨过敏原的阴性、阳性测定值进行χ² 检验和Kappa检验。检验水准（α）为0.05。

重复测定S0样本20次，计算得到LoD均小于0.01 U/mL，见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 LoD测定结果 Tab 1 Results of limit of detection (LoD) Sample Value zB/(U • mL－1) Allergen M (RLU) SD (RLU) M+2SD (RLU) LoD zB/(U • mL－1) S0 0 Dermatophagoides pteronyssinus 15 023 567 16 157 ＜0.01 S1 0.35 Dermatophagoides farinae 16 975 471 17 917 ＜0.01 M: Mean; SD: Standard deviation; RLU: Relative light unit

表 1 LoD测定结果 Tab 1 Results of limit of detection (LoD)

将测定浓度的平均值与理论浓度以最小二乘法进行直线拟合，得线性回归方程。屋尘螨线性回归方程为y＝0.999 1x+0.066 7（R²＝0.999 8），粉尘螨线性回归方程为y＝0.973 3x+0.603 7（R²＝0.999 1），屋尘螨和粉尘螨在0.1~100 U/mL范围内都呈现良好的线性关系。

使用高值、中值和低值3个不同浓度的样本重复测定10次，批内精密度均小于5%，精密度良好。见表 2。

表 2 (Tab 2)

表 2 屋尘螨和粉尘螨的批内精密度 Tab 2 Within-run precision of Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae Allergen Sample M zB/(U • mL－1) SD zB/(U • mL－1) Within-run precision (%) Dermatophagoides pteronyssinus Low value 0.50 0.007 1.4 Median value 5.34 0.080 1.5 High value 18.70 0.299 1.6 Dermatophagoides farinae Low value 0.61 0.021 3.5 Median value 7.24 0.123 1.7 High value 21.08 0.422 2.0 M: Mean; SD: Standard deviation

表 2 屋尘螨和粉尘螨的批内精密度 Tab 2 Within-run precision of Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae

使用高值、中值和低值3个不同浓度的样本重复测定4次，每天2次，连续测定10 d, 结果显示屋尘螨和粉尘螨检测试剂盒的批间精密度均小于8%，可满足临床应用。见表 3。

表 3 (Tab 3)

表 3 屋尘螨和粉尘螨的批间精密度 Tab 3 Between-run precision of Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae % Allergen Between-run precision Total-run precision Low value Median value High value Low value Median value High value Dermatophagoides pteronyssinus 7.2 7.1 6.8 9.5 9.4 8.9 Dermatophagoides farinae 7.0 6.8 7.1 9.3 8.5 8.2

表 3 屋尘螨和粉尘螨的批间精密度 Tab 3 Between-run precision of Dermatophagoides pteronyssinus and Dermatophagoides farinae

分别用NM-CLIA和免疫荧光法同时对244例屋尘螨疑似过敏患者和245例粉尘螨疑似过敏患者的血清样本进行屋尘螨和粉尘螨sIgE抗体检测，比对数据进行级别符合率分析。与免疫荧光法相比，屋尘螨过敏原的阳性符合率为95%，阴性符合率为92%，χ²＝174.45，P＜0.001，Kappa＝0.843，表明NM-CLIA和免疫荧光法有良好的一致性，且±1级符合率为95.6%，±2级符合率为96.1%，敏感度为96.1%，特异度为92.5%；粉尘螨过敏原的阳性符合率为91%，阴性符合率为97%，χ²＝154.26，P＜0.001，Kappa＝0.787，表明NM-CLIA和免疫荧光法有良好的一致性，且±1级符合率为94.2%，±2级符合率为94.2%，敏感度为94.2%，特异度为92.1%。见表 4。

表 4 (Tab 4)

表 4 NM-CLIA和免疫荧光法对屋尘螨、粉尘螨sIgE抗体的检测结果 Tab 4 Results of NM-CLIA and immunofluorescence in detecting D1 and D2 sIgE antibodies N＝489, n Immunofluorescence NM-CLIA (D1) NM-CLIA (D2) Positive Negative Total Positive Negative Total Positive 196 8 204 195 12 207 Negative 3 37 40 3 35 38 Total 199 45 244 198 47 245 NM-CLIA: Magnetic nanoparticle chemiluminescence immunoassay; D1: Dermatophagoides pteronyssinus; D2: Dermatophagoides farinae; sIgE: Specific immunoglobulin E

表 4 NM-CLIA和免疫荧光法对屋尘螨、粉尘螨sIgE抗体的检测结果 Tab 4 Results of NM-CLIA and immunofluorescence in detecting D1 and D2 sIgE antibodies

近年来过敏性疾病的发病率有逐渐升高的倾向，这可能与大气及环境的污染和食品添加剂的广泛应用等有关。在临床上很多患者无法确定过敏原，给疾病的预防和治疗带来了很大困难。过敏原检测的传统皮试方法不适用于Ⅰ型过敏性反应，急性期过敏性反应患者也不宜开展皮试，服用抗组胺、类固醇激素药物也会影响皮试结果。基于抗原抗体免疫反应的过敏原体外检测则克服了以上缺点^{[5, 18-19]}。近年来过敏性疾病基于IgE检测的体外诊断发展非常迅速，长期以来，国内多采用蛋白质免疫印迹、ELISA法等半定量方法检测过敏原sIgE抗体，这些检测方法学除了无法为临床提供详尽的定量信息外，还多是手工操作，由于受限于检测敏感度、线性范围和精密度等因素，不易进行质量控制，很难保证结果的准确性，导致临床应用价值下降。

检测系统是指完成一个检验项目所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、检验程序、保养计划等的组合。实现同一检验项目在不同检测系统检验结果的可比性，是实验室质量管理的最终目标^[16]，而对比试验的结果是各实验室、各检测系统间采取整改措施的前提。为了考察Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测系统的批间精密度和批内精密度，本研究分别选用了屋尘螨和粉尘螨高值、中值、低值3个不同浓度的样本作为盲样，在Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测仪上进行测定，结果显示，屋尘螨和粉尘螨的批内精密度均小于5%。批间精密度均小于8%，LoD均小于0.01 U/mL，表明Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测系统的批间精密度、批内精密度和LoD均符合临床要求，比对试验数据可靠。本研究所选择的2个系统分别测试了244例屋尘螨疑似过敏样本和245例粉尘螨疑似过敏样本，结果表明，两个系统之间χ² ＞3.84，P＜0.001，Kappa＞0.75，阳性符合率、±1级符合率和阴性符合率均大于90%，表现出良好的一致性。Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测系统所表现出的良好性能指标及其与国际主流测试系统（即本研究使用的美国赛默飞公司免疫荧光系统）的良好一致性表明Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测系统在临床检测中有优异的可靠性和巨大价值，有潜力成为临床检测过敏原sIgE的优选方案。

虽然尘螨过敏原sIgE的测定可以为过敏性疾病的诊断提供一定的临床指导，但并非所有sIgE升高都会引起过敏反应，此时应严格结合患者的临床症状进行确认^{[1, 17]}。一旦确认患者对特定的物质产生过敏反应，则应及时采取措施避免患者接触过敏原和给予积极的药物治疗。本研究中仅针对Lumiray 1600型纳米磁微粒化学发光检测系统在屋尘螨和粉尘螨sIgE检测方面的性能进行了全面评估，未来仍需要利用更多的明确诊断为过敏性疾病患者的血清样本对该系统其他过敏原sIgE抗体的检测进行更全面的评估和验证，为该系统的临床应用提供更充分的依据。