2017, Vol. 38
白龙解郁颗粒为本院自有制剂，具有镇静安神、除烦解郁、清热泻火的功效，主要用于治疗心烦意乱、情绪低沉、悲忧欲哭、善感多愁、躺而不寐、眠而不实或自觉全身不适、头目昏重、口燥咽干、重病焦虑等症状，临床疗效良好。法半夏为本方君药[1]，陈皮为臣药，炙甘草为使药，本研究主要是针对后两味药物。陈皮味苦、辛、温，能理气健脾，燥湿化痰。陈皮中主要含有挥发油、黄酮类、有机胺类及微量元素等成分[2]，其中橙皮苷属黄酮类，为陈皮的有效成分。《中华人民共和国药典》(2015版)一部以橙皮苷作为陈皮[3]药材含量的测定指标成分。本品处方为《局方》逍遥散合二陈汤加味而成，《中华人民共和国药典》(2015版)一部规定了二陈丸[3]的质量标准，其中在含量测定项下采用橙皮苷作为含量测定指标。茯苓、白术(炒)、薄荷、黄连、大黄(酒制)、牡蛎(煅)、龙骨(煅)为本方佐药，炙甘草为本方使药，除龙骨外，《中华人民共和国药典》(2015版)一部对上述各药材均有收载，其中薄荷、黄连、大黄、牡蛎、炙甘草均规定了含量测定项。有文献[4-5]报道甘草苷具有抗抑郁作用，因此，选择甘草苷作为本制剂的含量测定指标之一。
1 仪器和试药 1.1 仪器Agilent 1200型液相色谱仪(美国Agilent公司), Agilent SB-ZOBAX C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；梅特勒-托利多XA205型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；SB2200超声仪[必能信超声(上海)有限公司]；WL-901型旋涡振荡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
1.2 试药乙腈(德国默克公司，608-001-00-3)、磷酸(德国默克公司，603-001-00-X)、橙皮苷(中国食品药品检定所，110721-201316)、甘草苷(中国食品药品检定所，110721-201316)。白龙解郁颗粒，由本院制剂室制备，规格：12 g/袋，批号：151211、160527、161107；阴性对照颗粒由上海药谷药业有限公司制剂室制备；水为注射用水，实验室自制。
2 方法和结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 对照品储备液橙皮苷对照品溶液：精密称定橙皮苷对照品8.91 mg，置50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度178.2 μg/mL)，作为橙皮苷对照品储备液；甘草苷对照品溶液：精密称定甘草苷对照品10.84 mg，置50 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度216.8 μg/mL)，作为甘草苷对照品储备液。
2.1.2 样品溶液取白龙解郁颗粒12 g，研细过5号筛，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，密塞，称定质量，超声(功率200 W，频率40 kHz)处理25 min，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液备用。
2.1.3 空白溶液取12 g阴性对照颗粒，制法同“样品溶液”制备项。
2.2 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；选用Agilent SB-ZOBAX C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。橙皮苷的检测方法：乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78) 为流动相，柱温30 ℃，检测波长为283 nm，进样量10 μL。甘草苷的检测方法：乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82) 为流动相，柱温30 ℃，检测波长为276 nm，进样量10 μL。理论塔板数按橙皮苷或甘草苷峰计算应不低于10 000，目标峰与相邻色谱峰的分离度应大于1.5。检测图谱见图 1。
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图 1 橙皮苷和甘草苷检测的HPLC图谱 A:橙皮苷对照品溶液; B:橙皮苷检测样品溶液; C:缺陈皮空白对照溶液; D:甘草苷对照品溶液; E:甘草苷检测样品溶液; F:缺甘草空白对照溶液. 1:橙皮苷; 2:甘草苷. HPLC:高效液相色谱 |
2.3 方法学考察 2.3.1 线形范围
橙皮苷：精密量取橙皮苷的对照品储备溶液(浓度178.2 μg/mL) 2、4、6、8 mL，分别置于4个10 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为35.64、71.28、106.92、142.56 μg/mL的橙皮苷溶液。精密量取上述5种浓度的溶液各10 μL进样，记录色谱图，结果表明当橙皮苷的浓度为35.64~178.20 μg/mL时，橙皮苷的峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为：C=0.058A－1.022 9 (r=0.999 8，n=6)。
甘草苷：精密量取甘草苷的对照品储备溶液(浓度216.8 μg/mL) 5 mL，置于10 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀(浓度108.4 μg/mL)；同法逐一倍比稀释，得浓度分别为54.2、27.1、13.55 μg/mL的甘草苷溶液。精密量取上述5种浓度的溶液各10 μL进样，记录色谱图，结果表明当甘草苷的浓度为13.55~216.80 μg/mL时，甘草苷的峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为：C=0.060 7A+0.187 6 (r=0.999 9，n=6)。以上结果满足含量测定要求。
2.3.2 精密度分别取浓度为106.92 μg/mL橙皮苷对照品溶液、浓度为54.2 μg/mL的甘草苷对照品溶液，连续重复进样5次，经计算色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.4%、1.1%，结果满足含量测定要求。
2.3.3 稳定性按2.1.2项下方法制备1份供试品溶液，分别于0、1、4、8、24 h时进样分析，结果橙皮苷峰面积的RSD为0.7%，甘草苷峰面积的RSD为0.9%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性取白龙解郁颗粒10袋(批号161107)，研细，过5号筛，分别取6份1 g样品，按2.1.2项下方法配制供试品溶液。另取71.28 μg/mL橙皮苷对照品溶液和27.1 μg/mL甘草苷对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，在2.2项色谱条件进样分析，结果橙皮苷含量测定RSD为1.6%；甘草苷含量测定RSD为1.1%，均满足含量测定要求。
2.3.5 回收率取已知含量的样品粉末9份(橙皮苷含量1.707 1 mg/g), 每份0.5 g，精密称定，置于9个具塞锥形瓶中。另精密称取橙皮苷对照品21.4 mg至5 mL容量瓶中(溶剂为稀乙醇)，分别精密量取0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL容量瓶中制成浓度分别为136.8、171.2、204.4 μg/mL的橙皮苷对照品溶液。分别精密量取5 mL各3份，加入上述9个具塞锥形瓶中，再分别精密加入稀乙醇20 mL，密塞，按2.1.2项下方法配制供试品溶液。分别精密吸取浓度为70 μg/mL的对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样，按2.2项色谱条件进样分析，计算得平均加样回收率为99.30%，RSD为1.0%。
分别精密吸取甘草苷对照品溶液(216.8 μg/mL) 5、6、7 mL，置于3个25 mL量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为43.360、52.032、60.704 μg/mL的甘草苷对照品溶液。另取已知含量样品粉末9份(甘草苷含量0.513 mg/g), 每份0.5 g，精密称定，置于9个具塞锥形瓶中, 分别精密吸取上述3个浓度的甘草苷对照品溶液5 mL各3份(约相当于样品含量的80%、100%、120%)，分别加入上述9个具塞锥形瓶中，再精密加入稀乙醇20 mL，密塞，按2.1.2项下方法配制供试品溶液。分别精密吸取浓度为20 μg/mL的对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样，在2.2项色谱条件下分析，计算得平均加样回收率为98.60%，RSD为1.5%。
2.3.6 检测限及定量限当信噪比(S/N)为3时，橙皮苷和甘草苷的最低检测限分别为3.373、13.55 ng；当信噪比(S/N)为10时，橙皮苷和甘草苷的最低定量限分别为6.747、40.65 ng。
2.4 样品测定按2.1.2项下方法制备样品溶液(批号分别为151211、160527、161107)，在2.2项下色谱条件进样分析，根据标准曲线方程计算样品含量，结果见表 1。
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表 1 3批白龙解郁颗粒中橙皮苷、甘草苷的含量 |
3 讨论 3.1 检测波长的选择
橙皮苷、甘草苷在流动相中的紫外光谱分别见图 2A、2B。紫外图谱表明，橙皮苷和甘草苷的最大吸收波长分别为283、276 nm，所以选择作为检测波长。
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图 2 橙皮苷(A)、甘草苷(B)的紫外光谱图 |
3.2 提取方法的选择
参考文献[6]，对橙皮苷的提取方法进行了优化，分别考察了不同溶剂(甲醇、70%甲醇、稀乙醇)和不同超声处理时间(10、20、30 min)对橙皮苷提取效率的影响。实验结果表明，以稀乙醇为溶剂，超声25 min可以将样品中的橙皮苷提取完全。以稀乙醇为溶剂，分别考察了不同超声处理时间(15、25、35 min)对甘草苷提取效率的影响，实验结果表明，超声25 min可以将样品中的甘草苷提取完全。
本实验采用HPLC对白龙解郁颗粒中的橙皮苷和甘草苷分别进行了含量测定，方法学考察表明其精密度、重复性、稳定性、加样回收率均符合相关规定。本实验建立的方法简单、快捷、稳定可靠，为白龙解郁颗粒的质量控制提供了依据。
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| [3] | 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 一部. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 191, 438. |
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