第二军医大学学报  2017, Vol. 38 Issue (9): 1202-1205   PDF    
高效液相色谱法测定白龙解郁颗粒中橙皮苷和甘草苷的含量
陈小玲, 蔺红伟, 江春霞, 朴淑娟, 陆文铨     
第二军医大学长征医院药学部, 上海 200003
摘要: 目的 采用高效液相色谱法(HPLC)测定白龙解郁颗粒中橙皮苷和甘草苷的含量。方法 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,使用Agilent SB-ZOBAX C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)行HPLC。橙皮苷的测定:乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78)为流动相,柱温30℃,检测波长为283 nm,进样量10 μL;甘草苷的测定:乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82)为流动相,柱温30℃,检测波长为276 nm,进样量10 μL。结果 HPLC测定橙皮苷和甘草苷的精密度、重复性、稳定性的范围均符合相关规定;橙皮苷在35.64~178.20 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 8),甘草苷在13.55~216.80 μg/mL范围内线性关系良好(r=0.999 9);加样回收率分别为:橙皮苷99.30%,RSD为1.0%(n=9);甘草苷98.60%,RSD为1.5%(n=9)。结论 HPLC快捷、简单、稳定可靠,可用于白龙解郁颗粒的质量控制。
关键词: 橙皮苷     甘草苷     高压液相色谱法     白龙解郁颗粒    
Determination of hesperidin and liquiritin in Bailong Jieyu granule by high-performance liquid chromatography
CHEN Xiao-ling, LIN Hong-wei, JIANG Chun-xia, PIAO Shu-juan, LU Wen-quan     
Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003, China
Supported by Special Project for Improving of Preparation Quality Standard of Military Medical Institutions (14ZJZ04-1), Key Special Project of Clinical Pharmacy of Shanghai (2016-40044-002), and Important Weak Subject Construction Project of Shanghai Municipal Commission of Health and Family Planning (2016ZB0303).
Abstract: Objective To determine the contents of the hesperidin and liquiritin in Bailong Jieyu granule with high-performance liquid chromatography (HPLC). Methods HPLC was performed with octadecylsilane chemically bonded silica as filler using the Agilent SB-ZOBAX C18 Column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). Hesperidin was detected with the mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% of phosphoric acid solution (22:78), with column temperature being 30℃, the detection wavelength being 283 nm, and the injection volume being 10 μL. Liquiritin was determined with acetonitrile-0.1% of phosphoric acid solution (18:82) as mobile phase, with column temperature being 30℃, the detection wavelength being 276 nm, and the injection volume being 10 μL. Results Accuracy, repeatability and stability of HPLC for determination of hesperidin and liquiritin were in line with the relevant requirements. The linear relationship of hesperidin was good within the range of 35.64-178.20 μg/mL (r=0.999 8), with the average recovery rate being 99.30%, and relative standard deviation (RSD) being 1.0% (n=9). The good linear range of liquiritin was 13.55-216.80 μg/mL (r=0.999 9), with the average recovery rate being 98.60% and RSD being 1.5% (n=9). Conclusion HPLC method was fast, simple, stable and reliable, and it can be used for the quality control of Bailong Jieyu granule.
Key words: hesperidin     liquiritin     high-pressure liquid chromatography     Bailong Jieyu granule    

白龙解郁颗粒为本院自有制剂,具有镇静安神、除烦解郁、清热泻火的功效,主要用于治疗心烦意乱、情绪低沉、悲忧欲哭、善感多愁、躺而不寐、眠而不实或自觉全身不适、头目昏重、口燥咽干、重病焦虑等症状,临床疗效良好。法半夏为本方君药[1],陈皮为臣药,炙甘草为使药,本研究主要是针对后两味药物。陈皮味苦、辛、温,能理气健脾,燥湿化痰。陈皮中主要含有挥发油、黄酮类、有机胺类及微量元素等成分[2],其中橙皮苷属黄酮类,为陈皮的有效成分。《中华人民共和国药典》(2015版)一部以橙皮苷作为陈皮[3]药材含量的测定指标成分。本品处方为《局方》逍遥散合二陈汤加味而成,《中华人民共和国药典》(2015版)一部规定了二陈丸[3]的质量标准,其中在含量测定项下采用橙皮苷作为含量测定指标。茯苓、白术(炒)、薄荷、黄连、大黄(酒制)、牡蛎(煅)、龙骨(煅)为本方佐药,炙甘草为本方使药,除龙骨外,《中华人民共和国药典》(2015版)一部对上述各药材均有收载,其中薄荷、黄连、大黄、牡蛎、炙甘草均规定了含量测定项。有文献[4-5]报道甘草苷具有抗抑郁作用,因此,选择甘草苷作为本制剂的含量测定指标之一。

1 仪器和试药 1.1 仪器

Agilent 1200型液相色谱仪(美国Agilent公司), Agilent SB-ZOBAX C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);梅特勒-托利多XA205型电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司);SB2200超声仪[必能信超声(上海)有限公司];WL-901型旋涡振荡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 试药

乙腈(德国默克公司,608-001-00-3)、磷酸(德国默克公司,603-001-00-X)、橙皮苷(中国食品药品检定所,110721-201316)、甘草苷(中国食品药品检定所,110721-201316)。白龙解郁颗粒,由本院制剂室制备,规格:12 g/袋,批号:151211、160527、161107;阴性对照颗粒由上海药谷药业有限公司制剂室制备;水为注射用水,实验室自制。

2 方法和结果 2.1 溶液的配制 2.1.1 对照品储备液

橙皮苷对照品溶液:精密称定橙皮苷对照品8.91 mg,置50 mL量瓶中,加稀乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀(浓度178.2 μg/mL),作为橙皮苷对照品储备液;甘草苷对照品溶液:精密称定甘草苷对照品10.84 mg,置50 mL量瓶中,加稀乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀(浓度216.8 μg/mL),作为甘草苷对照品储备液。

2.1.2 样品溶液

取白龙解郁颗粒12 g,研细过5号筛,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入稀乙醇25 mL,密塞,称定质量,超声(功率200 W,频率40 kHz)处理25 min,放冷,再称定质量,用稀乙醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液备用。

2.1.3 空白溶液

取12 g阴性对照颗粒,制法同“样品溶液”制备项。

2.2 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;选用Agilent SB-ZOBAX C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。橙皮苷的检测方法:乙腈-0.1%磷酸溶液(22:78) 为流动相,柱温30 ℃,检测波长为283 nm,进样量10 μL。甘草苷的检测方法:乙腈-0.1%磷酸溶液(18:82) 为流动相,柱温30 ℃,检测波长为276 nm,进样量10 μL。理论塔板数按橙皮苷或甘草苷峰计算应不低于10 000,目标峰与相邻色谱峰的分离度应大于1.5。检测图谱见图 1

图 1 橙皮苷和甘草苷检测的HPLC图谱 A:橙皮苷对照品溶液; B:橙皮苷检测样品溶液; C:缺陈皮空白对照溶液; D:甘草苷对照品溶液; E:甘草苷检测样品溶液; F:缺甘草空白对照溶液. 1:橙皮苷; 2:甘草苷. HPLC:高效液相色谱

2.3 方法学考察 2.3.1 线形范围

橙皮苷:精密量取橙皮苷的对照品储备溶液(浓度178.2 μg/mL) 2、4、6、8 mL,分别置于4个10 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为35.64、71.28、106.92、142.56 μg/mL的橙皮苷溶液。精密量取上述5种浓度的溶液各10 μL进样,记录色谱图,结果表明当橙皮苷的浓度为35.64~178.20 μg/mL时,橙皮苷的峰面积与浓度呈良好的线性关系,回归方程为:C=0.058A-1.022 9 (r=0.999 8,n=6)。

甘草苷:精密量取甘草苷的对照品储备溶液(浓度216.8 μg/mL) 5 mL,置于10 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀(浓度108.4 μg/mL);同法逐一倍比稀释,得浓度分别为54.2、27.1、13.55 μg/mL的甘草苷溶液。精密量取上述5种浓度的溶液各10 μL进样,记录色谱图,结果表明当甘草苷的浓度为13.55~216.80 μg/mL时,甘草苷的峰面积与浓度呈良好的线性关系,回归方程为:C=0.060 7A+0.187 6 (r=0.999 9,n=6)。以上结果满足含量测定要求。

2.3.2 精密度

分别取浓度为106.92 μg/mL橙皮苷对照品溶液、浓度为54.2 μg/mL的甘草苷对照品溶液,连续重复进样5次,经计算色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为1.4%、1.1%,结果满足含量测定要求。

2.3.3 稳定性

按2.1.2项下方法制备1份供试品溶液,分别于0、1、4、8、24 h时进样分析,结果橙皮苷峰面积的RSD为0.7%,甘草苷峰面积的RSD为0.9%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 重复性

取白龙解郁颗粒10袋(批号161107),研细,过5号筛,分别取6份1 g样品,按2.1.2项下方法配制供试品溶液。另取71.28 μg/mL橙皮苷对照品溶液和27.1 μg/mL甘草苷对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL,在2.2项色谱条件进样分析,结果橙皮苷含量测定RSD为1.6%;甘草苷含量测定RSD为1.1%,均满足含量测定要求。

2.3.5 回收率

取已知含量的样品粉末9份(橙皮苷含量1.707 1 mg/g), 每份0.5 g,精密称定,置于9个具塞锥形瓶中。另精密称取橙皮苷对照品21.4 mg至5 mL容量瓶中(溶剂为稀乙醇),分别精密量取0.8、1.0、1.2 mL,置于25 mL容量瓶中制成浓度分别为136.8、171.2、204.4 μg/mL的橙皮苷对照品溶液。分别精密量取5 mL各3份,加入上述9个具塞锥形瓶中,再分别精密加入稀乙醇20 mL,密塞,按2.1.2项下方法配制供试品溶液。分别精密吸取浓度为70 μg/mL的对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样,按2.2项色谱条件进样分析,计算得平均加样回收率为99.30%,RSD为1.0%。

分别精密吸取甘草苷对照品溶液(216.8 μg/mL) 5、6、7 mL,置于3个25 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,得浓度分别为43.360、52.032、60.704 μg/mL的甘草苷对照品溶液。另取已知含量样品粉末9份(甘草苷含量0.513 mg/g), 每份0.5 g,精密称定,置于9个具塞锥形瓶中, 分别精密吸取上述3个浓度的甘草苷对照品溶液5 mL各3份(约相当于样品含量的80%、100%、120%),分别加入上述9个具塞锥形瓶中,再精密加入稀乙醇20 mL,密塞,按2.1.2项下方法配制供试品溶液。分别精密吸取浓度为20 μg/mL的对照品溶液和供试品溶液各10 μL进样,在2.2项色谱条件下分析,计算得平均加样回收率为98.60%,RSD为1.5%。

2.3.6 检测限及定量限

当信噪比(S/N)为3时,橙皮苷和甘草苷的最低检测限分别为3.373、13.55 ng;当信噪比(S/N)为10时,橙皮苷和甘草苷的最低定量限分别为6.747、40.65 ng。

2.4 样品测定

按2.1.2项下方法制备样品溶液(批号分别为151211、160527、161107),在2.2项下色谱条件进样分析,根据标准曲线方程计算样品含量,结果见表 1

表 1 3批白龙解郁颗粒中橙皮苷、甘草苷的含量

3 讨论 3.1 检测波长的选择

橙皮苷、甘草苷在流动相中的紫外光谱分别见图 2A2B。紫外图谱表明,橙皮苷和甘草苷的最大吸收波长分别为283、276 nm,所以选择作为检测波长。

图 2 橙皮苷(A)、甘草苷(B)的紫外光谱图

3.2 提取方法的选择

参考文献[6],对橙皮苷的提取方法进行了优化,分别考察了不同溶剂(甲醇、70%甲醇、稀乙醇)和不同超声处理时间(10、20、30 min)对橙皮苷提取效率的影响。实验结果表明,以稀乙醇为溶剂,超声25 min可以将样品中的橙皮苷提取完全。以稀乙醇为溶剂,分别考察了不同超声处理时间(15、25、35 min)对甘草苷提取效率的影响,实验结果表明,超声25 min可以将样品中的甘草苷提取完全。

本实验采用HPLC对白龙解郁颗粒中的橙皮苷和甘草苷分别进行了含量测定,方法学考察表明其精密度、重复性、稳定性、加样回收率均符合相关规定。本实验建立的方法简单、快捷、稳定可靠,为白龙解郁颗粒的质量控制提供了依据。

参考文献
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