第二军医大学学报  2017, Vol. 38 Issue (9): 1178-1182   PDF    
石菖蒲、安息香和苏合香挥发油促进罗丹明123的肠吸收作用及其机制
王世祥, 马翠翠, 王洁, 杨洋, 贾璞, 郑晓晖     
西北大学生命科学学院中药学系, 西安 710069
摘要: 目的 研究石菖蒲、安息香和苏合香挥发油促进罗丹明-123(Rho-123)的肠吸收作用及其机制。方法 制作大鼠肠外翻模型,向肠囊内注入1.0 mL K-R营养液,将肠囊悬浮于45.0 mL 37℃的K-R溶液中。向肠囊外溶液中分别加入浓度均为60 μg/mL的石菖蒲、安息香和苏合香挥发油,孵育30 min后加入Rho-123,用高效液相色谱-荧光检测法测定肠囊内Rho-123的含量。培养人结肠癌细胞Caco-2,分别加入浓度均为80 μg/mL的石菖蒲、安息香和苏合香挥发油作用48 h,应用流式细胞术检测P糖蛋白(P-gp)的表达;采用qPCR检测P-gp基因MDR1 mRNA的表达。结果 石菖蒲、安息香和苏合香挥发油均可增加大鼠空肠和回肠Rho-123的吸收速率常数和表观通透系数(P < 0.01),降低P-gp及其基因MDR1 mRNA的表达(3者作用的降低率分别为53.15%、55.10%、61.86%及55.41%、16.24%、38.46%;P < 0.01)。结论 抑制P-gp及其基因的表达可能是石菖蒲、安息香和苏合香挥发油促进Rho-123肠吸收的主要机制之一。
关键词: 石菖蒲     安息香     苏合香     挥发油     P糖蛋白    
Promoting effect of volatile oils of Shichangpu, benzoin or storax on intestinal absorption of Rhodamine-123 and its mechanisms
WANG Shi-xiang, MA Cui-cui, WANG Jie, YANG Yang, JIA Pu, ZHENG Xiao-hui     
Department of Traditional Chinese Medicine, College of Life Sciences, Northwest University, Xi'an 710069, Shaanxi, China
Supported by Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team of Ministry of Education of China (IRT_15R55) and Scientific Research Plan of Shaanxi Key Laboratory (15JS108).
Abstract: Objective To explore the intestinal absorption-promoting effect of volatile oils of Shichangpu, benzoin and storax on Rhodamine-123 (Rho-123) and its mechanisms. Methods Rat in vitro everted gut sac (EGS) model was made. The EGS was filled with 1.0 mL K-R solution, and suspended in 45.0 mL 37℃ K-R solution with or without 60 μg/mL volatile oils of Shichangpu, benzoin or storax. After incubation for 30 min, Rho-123 was added in the experimental solution outside the EGS. Rho-123 content in the EGS was determined by high-performance liquid chromatography-fluorescence detector. The human colon carcinoma cell lines Caco-2 were cultured in DMEM and incubated with 80 μg/mL volatile oils of Shichangpu, benzoin or storax for 48 h. P-glycoprotein (P-gp) expression in Caco-2 cells was assessed using flow cytometry, and P-gp gene MDR1 mRNA expression was determined by qPCR. Results The volatile oils of Shichangpu, benzoin and storax each significantly increased the absorption rate constant and apparent permeability coefficient of Rho-123 in rat jejunum and ileum (P < 0.01), reduced P-gp expression and MDR1 mRNA level in Caco-2 cells (the decreased rates of P-gp expression were 53.15%, 55.10% and 61.86%, and of MDR1 mRNA levels were 55.41%, 16.24% and 38.46%, P < 0.01). Conclusion Inhibiting the protein and MDR1 mRNA expressions of P-gp may be one of the main mechanisms of volatile oils of Shichangpu, benzoin and storax in promoting Rho-123 intestinal absorption.
Key words: Acorus tatarinowii     benzoin     storax     volatile oil     P-glycoprotein    

石菖蒲、安息香和苏合香为中药方剂中常用的芳香开窍药物,对脑缺血再灌注损伤大鼠的血脑屏障均具有明显的保护作用[1-2]。安息香、苏合香可提高小鼠大脑皮质和下丘脑中伊文思蓝含量,苏合香能增加海马和纹状体中罗丹明123(Rho-123) 的分布,且两者不影响血脑屏障的超微结构[3]。石菖蒲能松弛大鼠血脑屏障的紧密连接,增加脑内伊文思蓝和苯妥英钠的含量[4]。本研究组也发现,石菖蒲、安息香和苏合香可促进Caco-2细胞对Rho-123的摄取[5],石菖蒲能增加远志成分3, 4, 5-三甲氧基肉桂酸在兔体内的吸收[6],促进白芷成分花椒毒酚、水合氧化前胡素和白当归素在大鼠空肠和回肠的吸收以及在Caco-2细胞单层模型中的转运[7],但石菖蒲、安息香和苏合香促进药物吸收的机制仍不清晰。本研究采用大鼠肠外翻模型和Caco-2细胞,探讨石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对Rho-123肠转运的作用及其机制,为这3种药物与P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的药物配伍提供实验依据。

1 材料和方法 1.1 动物与细胞

SD雄性大鼠,SPF级,体质量(280±20) g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,动物生产许可证号:SCXK(陕) 2012-003。人结肠癌细胞株Caco-2购于中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂

石菖蒲、安息香和苏合香购于西安市药材市场,由西北大学生命科学学院房敏峰教授鉴定,分别为石菖蒲Acorus tatarinowii Schott.的干燥根茎、安息香科植物白花树Styrax tonkinensis(Pierre)Craib ex Hart的干燥树脂和苏合香树Liquidambar orientalis Mill.树干分泌的香树脂。DMEM高糖培养液、胎牛血清、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)和胰蛋白酶(美国Gibco公司);二甲基亚砜(DMSO)和Rho-123(美国Sigma-Aldrich公司);盐酸维拉帕米注射液(Ver;上海禾丰制药有限公司,生产批号:140127)。PE-UIC2荧光抗体、PE-IgG2a荧光同型对照抗体(美国eBioscience公司);SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、PrimeScript® RT reagent试剂盒和RNAiso Plus试剂(大连TaKaRa公司);琼脂糖(法国Biowest公司);DL2000 DNA Marker(北京鼎国昌盛生物公司)。

1.3 仪器

1100系列高效液相色谱仪(美国Agilent公司);C150 CO2培养箱(德国Binder公司);FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司);TE2000-U型倒置显微镜(日本Nikon公司);5804-R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);JY300C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司);WD-9413型凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂);iCycle荧光定量分析仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 石菖蒲、安息香和苏合香挥发油供试品溶液的制备

称取石菖蒲、安息香和苏合香干燥至恒质量的粉末(24~65目) 200.0 g,分别置于2 000 mL圆底烧瓶中,按照《中华人民共和国药典》挥发油测定法[8],收集石菖蒲(β-细辛醚70.8%,α-细辛醚5.4%)、安息香(安息香醛4.5%,香草醛0.56%、樟脑0.34%)和苏合香(安息香酸苄酯30.4%,安息香醛1.8%)挥发油。精密称取各挥发油适量,加入DMSO溶解,制备石菖蒲、安息香和苏合香挥发油10% DMSO供试品溶液,4 ℃冷藏备用。实验时,用相应的溶剂稀释成一定浓度。

1.5 肠外翻实验

按文献[9-10]方法,大鼠麻醉后,腹正中线切口2.0~3.0 cm,快速取出大鼠小肠,置于K-R营养液中,用冰凉的K-R液冲洗干净。分别量取空肠及回肠段10 cm,用光滑的玻璃棒翻转肠部,冲洗干净黏液,一端用丝线扎紧,另一端插入塑料套管(4.0 mm,外径)后用丝线结扎,向肠囊内注入1.0 mL K-R营养液。将外翻肠囊悬浮于45.0 mL 37 ℃的K-R溶液中,并通入95% O2+5% CO2。分别向肠囊外的K-R溶液中加入石菖蒲、安息香和苏合香挥发油(终浓度均为60 μg/mL),阳性对照组加入100 μg/mL Ver,正常对照组加入等容积的DMSO K-R溶液(DMSO终浓度均为0.05%)。孵育30 min后,向肠囊外K-R溶液中加入Rho-123(终浓度为1.9 μg/mL),分别于15、30、45、60、75、90 min时从塑料套管端取样0.2 mL,取样后向浆膜的腔室补充K-R营养液保持固定体积。K-R溶液中Rho-123的浓度采用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)方法[5]进行测定。Rho-123吸收量(Q)、吸收速率常数(Ka)和表观通透系数(Papp)按下列公式[10-11]计算:

(1)

Qn为第n个取样点Rho-123的吸收量;n为取样次数;V为肠囊的容积;Vi为取样量;Cn为第n个取样点Rho-123的浓度。

(2)

K为Rho-123的吸收量Q对取样时间t所得直线回归方程的斜率;A为肠囊转运药物的有效面积。

(3)

dQ/dt为单位时间Rho-123的吸收量;A为肠囊转运药物的有效面积;C0为肠囊外Rho-123的初始浓度。

1.6 MTT实验

将Caco-2细胞接种于含DMEM培养液的细胞培养瓶中,培养液中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸和1% L-谷氨酰胺。置于5% CO2、37 ℃的培养箱中培养。隔天更换培养液,当细胞生长至80%~90%融合时,用EDTA和胰酶消化并传代。

将Caco-2细胞(1×104/mL)接种于96孔培养板,培养24 h后,分别加入含有0.01%、0.1%、0.3%、0.8%和1.0%的Ver或石菖蒲、安息香和苏合香挥发油培养液2 μL,并设阴性对照孔和空白调零孔(各孔含DMSO的终浓度均为0.1%)。继续培养48 h,吸弃各孔的培养液,加5.0 mg/mL MTT溶液20 μL,继续培养4 h,弃去上清液后,用150 μL DMSO振荡10 min溶解结晶,酶标仪(490 mn)测定光密度(D)值。细胞存活率(%) =(给药孔D值/阴性对照孔D值)×100%。

1.7 流式细胞术测定Caco-2细胞P-gp蛋白的表达

取浓度均为80 μg/mL的石菖蒲、安息香和苏合香挥发油及10 μg/mL Ver分别与Caco-2细胞作用48 h后,消化并吹打制成单细胞悬液。4 ℃ 300×g离心10 min,用4 ℃冷藏的PBS洗涤2次。将细胞稀释至1×107/mL,加药组各取100 μL细胞。未加药细胞取2份,一份设为同型对照组,加入PE-IgG2a同型对照抗体5 μL;另一份设为阴性细胞组,与加药物组一起各加入PE-UIC2荧光抗体5 μL,4 ℃孵育30 min,冰冷的PBS洗涤2次,300×g离心10 min,用0.5 mL PBS重悬,流式细胞仪测定荧光强度。

1.8 qPCR测定Caco-2细胞P-gp基因MDR1 mRNA的表达

用TRIzol法提取总RNA,cDNA合成按照PrimeScript® RT reagent试剂盒说明书操作:37 ℃ 15 min×3反转录,85 ℃ 5 s失活。qPCR按照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书进行操作。MDR1上游引物序列:5′-TCA GAC AGG ATG TGA GTT G-3′,下游引物序列:5′-AAT TAC AGC AAG CCT GGA ACC-3′。内参GAPDH上游引物序列:5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′,下游引物序列:5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′。反应条件:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 3 s、60 ℃ 30 s,40个循环。采用相对量分析法计算药物组MDR1 mRNA表达。

1.9 统计学处理

应用SPSS 16.0软件处理数据,两组间差异比较采用独立样本t检验,检验水准(α)为0.05。

2 结果 2.1 各挥发油对大鼠肠外翻模型肠囊Rho-123 Ka和Papp的影响

实验结果(表 1)表明,石菖蒲、安息香和苏合香挥发油均可增加Rho-123的Ka和Papp(P均<0.01);空肠和回肠的Ka分别为正常对照组的1.41、1.16和1.17倍及1.36、1.73和1.65倍,Papp分别为正常对照组的1.47、1.21和1.22倍及1.28、1.73和1.68倍。

表 1 石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对大鼠外翻肠囊Rho-123 Ka和Papp的影响 Tab 1 Effects of volatile oils (VOs) of Shichangpu, benzoin and storax on absorption rate constant (Ka) and apparent permeability coefficient (Papp) of Rhodamine (Rho)-123 in rat everted gut sac

2.2 各挥发油对Caco-2细胞存活率的影响

1.0~80.0 μg/mL石菖蒲、安息香和苏合香挥发油作用48 h后,细胞的存活率均大于90.0%,说明在此剂量范围内石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对Caco-2细胞均无明显的毒性作用(表 2)。

表 2 石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对Caco-2细胞存活率的影响 Tab 2 Effects of volatile oils (VOs) of Shichangpu, benzoin and storax on survival rate of Caco-2 cells

2.3 各挥发油对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响

选择80 μg/mL浓度研究了石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对Caco-2细胞P-gp蛋白表达的影响。结果表明,石菖蒲、安息香和苏合香挥发油均可降低P-gp蛋白表达(P<0.01),其降低率分别为53.15%、55.10%和61.86%。苏合香挥发油作用优于石菖蒲和安息香挥发油,而石菖蒲和安息香挥发油的作用差异无统计学意义(表 3)。

表 3 石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对P-gp蛋白及其基因MDR1表达的影响 Tab 3 Effects of volatile oils (VOs) of Shichangpu, benzoin and storax on protein and MDR1 mRNA expression of P-glycoprotein (P-gp)

2.4 各挥发油对Caco-2细胞MDR1 mRNA表达的影响

80 μg/mL石菖蒲、安息香和苏合香挥发油作用48 h能降低Caco-2细胞P-gp基因MDR1 mRNA的表达,其降低率分别为55.41%、16.24%和38.46%。同等浓度下,石菖蒲挥发油作用最强,苏合香挥发油的作用次之,安息香挥发油作用最弱(表 3)。

3 讨论

P-gp为多药耐药性基因MDR表达的产物,是机体产生多药耐药性的主要原因[12-13]。P-gp不仅在肿瘤细胞上高表达,而且在机体的胃肠道、脑微血管内皮细胞、脑腔面膜、肾近曲小管上皮细胞、睾丸毛细血管内皮细胞、肝小管膜和合体滋养层细胞表面等部位均有表达[14-19],能将外源性物质排出体外,从而影响药物的吸收和分布[20]

在中药方剂中,石菖蒲、安息香和苏合香常作为使药,可引导其他药物直达病所,从而发挥治疗作用[21-22]。本研究组前期证实,苏合香、安息香和石菖蒲有效成分安息香醛、香草醛和β-细辛醚可促进Rho-123在Caco-2细胞内的聚集,降低细胞培养液中Rho-123的含量[5]。本研究结果表明,石菖蒲、安息香和苏合香挥发油均可促进大鼠空肠和回肠对P-gp底物Rho-123的吸收,增加Rho-123的Ka和Papp。结果提示,石菖蒲、安息香和苏合香挥发油促进Rho-123的吸收作用可能与抑制P-gp有关。

总之,本研究结果表明石菖蒲、安息香和苏合香挥发油均可使Caco-2细胞P-蛋白及其基因MDR1 mRNA的表达降低,提示抑制P-gp及其基因的表达可能为石菖蒲、安息香和苏合香促进药物吸收和分布的主要作用机制之一。同时本研究还发现,石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对P-gp蛋白的表达和对MDR1 mRNA的表达的抑制作用强弱并不一致,可能是由于石菖蒲、安息香和苏合香挥发油对P-gp的转录和翻译作用不同所致。

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