肺癌目前仍然是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有支气管肺癌病理类型的80%以上，其恶性程度高，疾病进展快，5年生存率仅约11%^[1]。NSCLC侵袭转移及多药耐药是其临床治疗的两大难点，也是影响患者预后、导致死亡的主要原因。因此，阐明NSCLC转移的分子机制对其治疗和预后具有重要意义。

Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1) 是Hippo信号通路下游关键转录因子^[2-3]。Hippo/YAP1通路是近年新发现的一条细胞信号传导通路，可通过调节组织细胞增殖和凋亡平衡调控机体器官的大小。该通路调控异常可导致多种疾病的发生^{[2, 4]}，包括多种恶性肿瘤，如肝癌^[5]、胆囊癌^[6]、乳腺癌^[7]、肺癌^[8]、胰腺癌^[9]和食管癌^[10]等。目前认为YAP1基因可能是致癌基因，在许多肿瘤中高表达^{[6, 9-11]}。例如，Li等^[6]发现胆囊癌组织中YAP1及其靶蛋白AXL高表达，且该表达水平与不良预后相关。他们利用慢病毒载体介导的小干扰RNA沉默YAP1基因表达，通过减少细胞周期相关蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)、细胞分裂周期蛋白25A (CDC25A)和细胞周期蛋白A (cyclin A)的表达，致胆囊癌细胞停滞于S期，降低肿瘤细胞增殖；进一步的机制研究发现，AXL/MAPK信号途径参与了YAP1相关的肿瘤进展。本研究通过慢病毒介导的RNA干扰靶向抑制人NSCLC细胞株A549中YAP1基因的表达，研究YAP1是否作为癌基因调控NSCLC细胞的增殖及细胞周期，并探讨YAP1基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响。

慢病毒靶向YAP1干扰载体(si-YAP1)、慢病毒包裹的无关RNA载体(si-NC)均由中国人民解放军胸心外科研究所构建。人NSCLC细胞株A549购自中国科学院上海细胞库。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM培养液为美国Gibco公司产品，Transwell培养小室购自美国Millipore公司，YAP1抗体(货号：4912) 购自美国CST公司，RNase A、碘化丙啶(propidium iodide，PI)及GAPDH抗体(货号：SAB2701826) 购自美国Sigma公司，qPCR引物由TaKaRa公司合成及测序。

A549细胞所用培养液为含10%小牛血清、100 μg/mL链霉素和100 IU/mL青霉素的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，取对数生长期A549细胞进行细胞实验。A549细胞接种于24孔培养板培养，至密度约80%时，根据随机数字表，取3孔细胞计数，按感染复数(MOI)为150加入慢病毒载体si-YAP1(设为实验组)；再取3孔细胞计数后，按MOI为150加入无关病毒载体si-NC(设为阴性对照组)；另取3孔细胞计数后，加入PBS(设为空白对照组)。根据预实验确定的感染条件，利用滴度为1×10⁹ TU/mL病毒原液60 μL与polybrene 3 μL感染数目为1.5×10⁵的A549细胞。由于病毒质粒中含有编码的绿色荧光蛋白(GFP)基因，利用荧光显微镜可根据荧光强度估算细胞感染效率。以293T细胞作为参照。待293T细胞和各组A549细胞感染48 h后，随机选择5个视野计数，荧光显微镜下观察病毒感染情况，计算绿色荧光细胞占全部细胞的比例，即为感染效率。

本研究所用YAP1引物及β-actin引物序列根据文献[12]设计，由TaKaRa公司合成。引物序列：YAP1正向引物5′-CAG CAA CTG CAG ATG GAG AA-3′，反向引物5′-ACA TCC CGG GAG AAG ACA CT-3′；β-actin正向引物5′-CGT CTT CCC CTC CAT CGT-3′，反向引物5′-GAA GGT GTG GTG CCA GAT TT-3′。利用TRIzol试剂提取各组A549细胞的总RNA，经反转录反应得到cDNA后再采用TaqMan法进行qPCR反应并定量。qPCR反应条件为：94 ℃ 30 s、57 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，共32个循环；最后72 ℃延伸15 min。

A549细胞经慢病毒感染72 h后，收集细胞，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。蛋白样品加样(50 μg/孔)、电泳、转膜、封闭，4 ℃冰箱过夜标记一抗YAP1(1:1 000比例稀释)和GAPDH(1:2 000比例稀释)。用TBST洗膜3次(10 min/次)，37 ℃孵育1 h标记相应二抗，再用TBST洗膜3次(10 min/次)。曝光、显影及定影，扫描X线胶片，进行半定量分析。

慢病毒感染各组A549细胞72 h后，用0.25%胰酶消化细胞，再用含10%小牛血清的DMEM培养液稀释成密度为2×10⁴/mL的细胞悬液，按100 μL/孔接种于96孔培养板，每个样本设3个复孔。细胞接种后水平放置于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度条件下培养。于细胞接种后24、48、72、96、120 h各取出一块96孔板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。37 ℃培养箱中继续培养2 h，待形成的Formazan的量显色足够时，在酶标仪上测定450 nm处的光密度(D)值，绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

待各组A549细胞处于对数生长期后，收集细胞，铺板，每组3复孔，每孔100 μL(细胞数约为每孔2 000)。各组细胞经慢病毒处理48 h后，待细胞贴壁，收集细胞，加入70%冷乙醇，使细胞固定，过夜后用PBS清洗1次，再加入RNase A在37 ℃水浴中消化30 min，PI避光染色30 min，上流式细胞仪进行细胞周期分布检测，并计算凋亡期细胞所占比例。

体外侵袭实验采用美国Millipore公司的聚碳酸酯膜(8 μm孔径)侵袭小室，以无血清DMEM培养液稀释Matrigel胶，使之浓度达4.0 μg/μL，并铺到Transwell上室，放在37 ℃孵育箱中，经30 min后Matrigel胶聚合成凝胶，进而成为基底膜。接着，在Transwell下室加入含5 g/mL纤维粘连蛋白(FN)的DMEM培养液，上室加入si-YAP1组或si-NC组细胞500 μL (细胞密度约10⁶/mL)，每组设3个复孔；在37 ℃孵育箱培养1 d后，丢弃上室培养液，取出上室，用湿棉签轻轻拭去未穿过膜的细胞，经0.1%结晶紫染色、PBS洗涤、风干后，用Clearmont双侧封片，放入80 ℃烤箱中烤干，利用荧光倒置显微镜观察拍照(100倍视野下)。计数方法为：在每张膜中央和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内穿膜的细胞数。实验重复3次。细胞数越多，表示细胞侵袭能力越强。

所有数据应用SPSS 19.0软件进行统计分析。结果均以x±s表示，两组间比较采用t检验。检验水准(α)为0.05。

本研究中293T细胞和A549细胞的感染效率分别为(92.0±6.2)%和(81.0±3.6)%(图 1A)。分别收集感染48 h的si-YAP1组及si-NC组细胞，进行qPCR(图 1B)和蛋白质印迹法(图 1C)检测，结果显示干扰YAP1后YAP1 mRNA及蛋白的表达均低于si-NC组，差异有统计学意义(P < 0.01)。

图 1 慢病毒干扰A549细胞YAP1表达的验证结果 Fig 1 Lentivirus-mediated siRNA stably decreased YAP1 expression in A549 cells A: Infection efficiency in A549 cells was estimated by fluorescent micrograph (original magnification: ×200); B: qPCR was used to assay YAP1 mRNA expression in A549 cell lines; C: Infection efficiency in A549 cells was estimated by Western blotting analysis. YAP1: Yes-associated protein 1. **P < 0.01 vs si-NC group. n=3, x±s

为了检测YAP1对A549细胞增殖的影响，我们采用CCK-8试剂盒比较干扰YAP1的表达后A549细胞的增殖情况。从24 h后si-NC组细胞增殖开始快于si-YAP1组, 72 h后两组差异有统计学意义(P < 0.05，P < 0.01；图 2)，说明下调YAP1的表达能够抑制A549细胞的增殖。

图 2 靶向沉默YAP1对A549细胞增殖的影响 Fig 2 Effect of YAP1 silencing on A549 cell proliferation YAP1: Yes-associated protein 1. *P < 0.05, **P < 0.01 vs si-YAP1 group. n=3, x±s

为了解沉默YAP1对A549细胞周期的影响，本研究将si-YAP1组及si-NC组的细胞周期进行比较。结果如表 1所示，沉默YAP1后，A549细胞周期停滞于G₀/G₁的细胞较si-NC组增加(P=0.001)，而S期((P=0.041) 及G₂/M期((P=0.009) 的细胞与si-NC组相比均减少；沉默YAP1后A549细胞凋亡较si-NC组也增加(P < 0.001)。

表 1 (Tab 1)

表 1 靶向沉默YAP1对细胞周期的影响 Tab 1 Effect of YAP1 silencing on A549 cell cycle progression %，n=3，x±s Cell cycle si-NC si-YAP1 P value G0/G1 phage 40.3±3.8 53.4±4.1 0.001 G2/M phage 23.8±3.0 15.4±1.9 0.009 S phage 36.6±1.2 28.0±3.2 0.041 Apoptosis 0.5±0.5 3.2±1.1 < 0.001 YAP1：Yes-associated protein 1

表 1 靶向沉默YAP1对细胞周期的影响 Tab 1 Effect of YAP1 silencing on A549 cell cycle progression

Transwell实验结果(图 3)示，si-NC组每个100倍视野穿过不含Matrigel滤膜的平均细胞数为228±13，高于si-YAP1组(78±14，P < 0.01)。同样，si-NC组每个100倍视野穿过含Matrgel滤膜的平均细胞数为178±11，高于si-YAP1组(68±12，P < 0.01)。说明YAP1基因沉默后A549细胞的迁移和侵袭能力受到抑制。

图 3 靶向沉默YAP1对A549细胞侵袭(A，B)及迁移(C，D)能力的影响 Fig 3 Effect of YAP1 silencing on invasion (A, B) and migration (C, D) of A549 cells YAP1: Yes-associated protein 1. Original magnification: ×100 (A, C). **P < 0.01 vs si-NC group. n=3, x±s

Hippo/YAP1是近年来发现的可通过调节细胞增殖和凋亡平衡，调控器官体积的信号分子转导通路。近年研究表明，Hippo/YAP1信号通路转导异常与多种疾病的发生、发展密切相关^{[2, 10]}。Sudol等^[13]于1995年首先报道了YAP1蛋白，人类YAP1基因位于11q13染色体，YAP1蛋白的相对分子质量约65 000，作为Hippo信号通路下游重要的转录因子，其在正常机体细胞内发挥信号转导和基因转录调节的作用。

本实验构建靶向YAP1基因的慢病毒干扰载体，感染肺癌细胞株A549和工具细胞293T，72 h后荧光显微镜显示沉默效率大于80%，说明构建的慢病毒干扰载体si-YAP1可有效沉默YAP1表达，可用于下一步实验。qPCR及蛋白质印迹法结果都证明A549细胞感染YAP1慢病毒干扰载体后，YAP1的mRNA和蛋白表达均下调，而无关病毒载体对YAP1的mRNA和蛋白表达没有明显影响，说明靶向YAP1的小干扰RNA可高效沉默A549细胞YAP1基因及蛋白的表达。

细胞过度增殖、细胞周期失控是肿瘤发生的重要生物学基础。Tschaharganeh等^[14]的研究发现在人肝癌细胞和鼠肝细胞中Notch信号通路配体Jagged-1(Jag-1) 表达增加，激活Notch信号通路，进而调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。进一步研究发现，这一过程需YAP1与其转录伴侣TEAD4结合，Mst1/2而不是β-catenin的存在保证了TEAD4的结合。本实验结果显示，与阴性对照相比，YAP1基因沉默后，A549细胞增殖能力降低。细胞增殖是通过细胞周期的运行来实现的，若细胞的正常周期阻滞功能失调，则导致细胞增殖失控，最终形成肿瘤。流式细胞实验结果发现，YAP1基因沉默后A549细胞周期的分布发生变化，S期的细胞比例减少，G₀/G₁期细胞比例增加，凋亡细胞增加。以上结果提示，YAP1基因促进细胞增殖可能和细胞周期改变有关，具体机制是否与细胞周期蛋白的激活调控有关尚需进一步研究。

肿瘤的侵袭和转移是一系列多因素、多信号通路相互作用的结果。研究表明，过表达YAP1基因能促进癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)^[15]，EMT与恶性肿瘤细胞侵袭转移能力及临床预后密切相关^[16]。例如，Shao等^[15]发现，在肺癌中YAP1与KRAS共同作用活化转化因子FOS，从而可能通过激活EMT相关的信号通路促进小鼠肺癌复发、侵袭及转移。

本研究表明慢病毒载体介导的小干扰RNA可有效抑制人NSCLC细胞株A549中YAP1 mRNA和蛋白的表达，从而抑制细胞增殖、侵袭。进一步研究YAP1在肿瘤侵袭、转移中的调节机制将有助于发现新的抗肿瘤靶点。