眼附属器淋巴瘤是临床比较常见的一种眼眶恶性肿瘤。原发于眼附属器的淋巴瘤90%以上是惰性的小B细胞来源肿瘤，以黏膜相关淋巴组织(mucosa-associated lymphoid tissue, MALT)淋巴瘤最为常见^[1-2]。有证据表明MALT淋巴瘤的发病机制可能与慢性病原微生物(如细菌、病毒)或自身免疫反应的刺激有关^[3]，但目前对MALT淋巴瘤的发病机制尚不是十分清楚。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类普遍存在于动植物中、长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，通过转录后调控mRNA参与细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育等一系列重要生命进程^[4]。MiR-150定位于人类染色体19q13.33，对B细胞和T细胞的成熟、胚胎发育以及干细胞分化等具有重要作用^[5]。我们前期研究表明，miR-150在MALT淋巴瘤中表达异常^[6]，提示miR-150可能参与MALT淋巴瘤的发生和发展。Cbl家族是重要的E3泛素连接酶，其成员Cbl-b具有抑制肿瘤发生、发展的作用，且该作用与miRNA有关，如Cbl-b可通过调控ZEB2和miR-200c抑制胃癌细胞中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1) 诱导的上皮间质转化^[7]，还可作为miR-891b的下游靶点抑制胰腺癌细胞的增殖^[8]。本研究旨在探讨miR-150是否参与结膜MALT淋巴瘤的发生、发展，以及Cbl-b是否作为miR-150下游分子在结膜MALT淋巴瘤的增殖、迁移和侵袭过程中发挥调控作用，为进一步了解MALT淋巴瘤的发生机制及寻找潜在的治疗靶点提供依据。

本研究中3例眼附属器结膜MALT淋巴瘤样本均采集于第二军医大学长征医院眼科2016年7月至10月收治的结膜MALT淋巴瘤患者。患者均为男性，年龄40~70岁，发病时间3个月至6年。采集患者行前路经皮开眶取瘤术所获取的MALT淋巴瘤，以及少量瘤旁组织。所有患者除患有结膜MALT淋巴瘤外无其他疾病。本研究经第二军医大学长征医院伦理委员会审批通过。所有患者均签署知情同意书。

用TRIzol试剂(Invitrogen)抽提MALT淋巴瘤组织及其瘤旁组织的总RNA，通过PrimeScrip反转录试剂盒将1 μg总RNA转录成单链cDNA。于8联管中配制qPCR体系：JumpStar Taq ReadyMix (Sigma) 10 μL，Evagreen dye荧光染料(Biotium) 1 μL，cDNA 25 ng，引物混合物(各5 μmol/L)0.8 μL，加灭菌水至20 μL。qPCR仪为Roche公司产品。qPCR程序如下：95 ℃ 5 min；95 ℃30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共43个循环；95 ℃ 30 s；65 ℃ 2 min；然后按照0.11 ℃/s升温至95 ℃，在升温过程每升高0.2 ℃采集一次荧光值；最后降温至20 ℃结束反应。qPCR引物序列见表 1。

表 1 (Tab 1)

表 1 qPCR引物序列 Tab 1 Primer sequence for qPCR

表 1 qPCR引物序列 Tab 1 Primer sequence for qPCR

MiR-150抑制物序列(5′-CAC UGG UAC AAG GGU UGG GAG A-3′)、模拟物序列(sense 5′-UCU CCC AAC CCU UGU ACC AGU G-3′, antisense 5′-CUG GUA CAA GGG UUG GGA GAU U-3′)和阴性对照(货号B04005) 由上海吉玛制药技术有限公司代为合成，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，胎牛血清(FBS)。RPMI 1640培养基(Gibco)，Matrigel基质胶(Biocate)，Hoechst 33342 (Sigma)，DMRIE-C转染试剂(Invitrogen)，Lipofectamine 3000转染试剂、Opti-MEM培养液(Thermo)，兔抗-Cbl-b、小鼠抗-GAPDH (Santa Cruz)。酶标仪(Thermo)，Transwell板(Corning)，高内涵成像(Perkin Elmer)，流式细胞仪(Beckman)，离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。

人多发性骨髓瘤细胞RPMI 8226购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。细胞为悬浮细胞，常规培养于含10%FBS的RPMI 1640培养液中，细胞每4 d按照1:3比例传代。

消化收集对数生长期的RPMI 8226细胞，PBS重悬、血细胞计数板计数，弃上清，用Opti-MEM培养液重悬细胞；以每孔3×10⁵的细胞密度接种于24孔板。待贴壁后使用Lipofectamine 3000和DMRIE-C转染试剂将miR-150抑制物转染至细胞，转染24、48 h后确定转染效率。

收集对数生长期的细胞，以每孔5×10⁴的细胞密度接种于96孔板，设置4复孔，37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h。将miR-150抑制物和阴性对照分别转染至细胞，处理24、48、72、96、120 h后，加入CCK-8溶液10 μL，于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱内继续孵育4 h，酶标仪检测(波长450 nm)，绘制生长曲线，并计算细胞相对增殖率[实验组光密度(D)值/空白对照组D值×100%]。

取对数生长期的RPMI 8226细胞，将miR-150抑制物和阴性对照分别转染至细胞，转染72 h后，收集细胞，112×g离心5 min，用预冷的PBS缓冲液洗2次；加入100 μL结合缓冲液，加入7-AAD和PE各5 μL，室温避光孵育30 min；加入400 μL结合缓冲液上流式细胞仪检测。

细胞侵袭实验：在Transwell板上室底部中央垂直加入100 μL Matrigel基质胶，37 ℃温育30 min。取对数生长期的RPMI 8226细胞，转染miR-150抑制物和阴性对照。转染72 h后，112×g离心3 min，弃上清；用PBS重悬细胞，离心弃上清；用Opti-MEM重悬、调整细胞密度为3×10⁵/mL，在Transwell板下室加入600 μL含20% FBS的培养液，上室加入150 μL细胞悬液，37 ℃、5% CO₂、饱和湿度条件下继续培养24 h。后吸去上室细胞悬液，取出上室，棉签轻轻擦去上室贴壁细胞，将上室放入Hoechst 33342染液中室温染色5 min，重新放入新的Transwell板中，于20倍镜下随机选取10个视野拍照并分析。

细胞迁移实验：除Transwell板上室底部不加Matrigel基质胶外，其余步骤同细胞侵袭实验。

RPMI 8226细胞分别转染miR-150模拟物、miR-150抑制物和阴性对照72 h后, 离心收集细胞并置于RIPA裂解液中，研磨后，12 000×g 4 ℃离心15 min, 取上清。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取等量的蛋白样品行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至PVDF膜上。将PVDF膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，随后4 ℃标记一抗(小鼠抗-Cbl-b, 1:300；小鼠抗-GAPDH, 1:5 000) 24 h；然后TBST清洗3次，每次10 min；再于二抗中室温孵育2 h。TBST清洗3次后，使用ECL试剂盒显色。蛋白条带灰度值使用ImageJ软件进行分析。

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。数据以x±s_x表示，瘤旁和肿瘤组织两组间均数的比较采用配对t检验，其余实验两组间均数比较采用Student’s t检验，两组以上均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，增殖率的比较采用双因素方差分析(two-way ANOVA)。检验水准(α)为0.05。

结果显示，与瘤旁组织相比，3例患者淋巴瘤组织中miR-150的表达水平均上调(P＜0.05，图 1)。

图 1 qPCR检测MALT淋巴瘤中miR-150的表达 Fig 1 MiR-150 levels in MALT lymphoma tissues by qPCR MALT: Mucosa-associated lymphoid tissue; NCT: Negative adjacent control tissue; 1, 2 and 3 indicate the first, second and third patients, respectively. n=3,x±sx. *P < 0.05, **P < 0.01

RPMI 8226细胞培养于含10% FBS的RPMI 1640培养液中，为悬浮细胞，圆形，状态较好(图 2A、2B)。转染48 h后，荧光显微镜观察Lipofectamine 3000和DMRIE-C转染miRNA-FAM的表达情况。结果显示，Lipofectamine 3000转染组细胞内未见FAM标记的mi-RNA信号(图 2C); 而DMRIE-C转染组中，DMRIE-C 1.5 μL、miRNA 2 μL、无血清的转染效果最好(图 2D)。

图 2 RPMI 8226细胞形态及miR-150抑制物的转染效率 Fig 2 Morphology of RPMI 8226 cells and transfection efficiency of miR-150 inhibitor A, B: Cultured RPMI 8226 cells; C: RPMI 8226 cells tansfected with Lipofectamine 3000 and miRNA-FAM; D: RPMI 8226 cells transfected with DMRIE-C and miRNA-FAM. Original magnification: ×40 (A), ×80 (B-D)

与阴性对照组相比，转染miR-150抑制物可以抑制RPMI 8226细胞的增殖，在120 h时差异有统计学意义(P＜0.01，图 3)。相对于阴性对照组，转染miR-150抑制物24、48、72、96、120 h后，细胞相对增殖率分别为121.4%、103.6%、100.7%、87.5%、85.8%。

图 3 转染miR-150抑制剂后RPMI 8226细胞的增殖曲线 Fig 3 The proliferation curve of RPMI 8226 cells transfected with MiR-150 inhibitor **P < 0.01 vs negative control. n=4,x±sx

通过Transwell实验检测抑制miR-150对RPMI 8226细胞迁移的影响。结果显示，转染72 h后，miR-150抑制物组穿膜细胞数仅为阴性对照组的(57.7±7.8)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.01，图 4A、4C)。通过在Transwell板上室底部中央铺Matrigel基质胶，检测抑制miR-150对RPMI 8226细胞侵袭的影响。结果显示，转染72 h后，miR-150抑制剂组穿膜细胞数仅为阴性对照组的(69.7±1.7)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.05，图 4B、4D)。说明抑制miR-150对RPMI 8226细胞的迁移与侵袭均具有抑制作用。

图 4 转染miR-150抑制物对RPMI 8226细胞迁移和侵袭的影响 Fig 4 Effect of miR-150 inhibitor on the migration and invasion of RPMI 8226 cells A, C: Results of migration by Transwell assay; B, D: Results of invasion by Transwell assay. *P < 0.05, **P < 0.01 vs negative control. n=3, x±sx

通过流式细胞术检测抑制miR-150对RPMI 8226细胞凋亡的影响。结果显示，正常组细胞凋亡率为(0.07±0.01)%，阴性对照组凋亡率为(6.35±0.64)%，而miR-150抑制物组凋亡率为(17.1±0.42)%。与正常组和阴性对照组相比，miR-150抑制物组细胞凋亡增加，差异有统计学意义(P＜0.01，图 5)。

图 5 转染miR-150抑制物对RPMI 8226细胞凋亡的影响 Fig 5 Apoptosis in RPMI 8226 cells after treatment with miR-150 inhibitor

通过qPCR检测3例结膜MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中Cbl-b的表达情况。结果显示，与瘤旁组织相比，3例患者MALT淋巴瘤中Cbl-b mRNA的表达水平分别下调了约76%、80%和86% (P＜0.01，图 6)。为了进一步研究miR-150对Cbl-b的调控作用，通过蛋白质印法迹检测抑制和过表达miR-150后RPMI 8226细胞中Cbl-b蛋白的表达。结果显示，与阴性对照组相比，RPMI 8226细胞转染miR-150模拟物后Cbl-b蛋白的表达呈下调趋势但差异无统计学意义(P＞0.05)，而转染miR-150抑制物后Cbl-b蛋白表达上调(P＜0.01)。

图 6 MALT淋巴瘤组织中Cbl-b mRNA的表达以及miR-150对RPMI 8226细胞中Cbl-b蛋白表达的影响 Fig 6 Cbl-b mRNA expression in MALT lymphoma tissues and effect of miR-150 on Cbl-b protein expression in RPMI 8226 cells A: The expression of Cbl-b mRNA realted to NCT by qPCR; B, C: Western blotting results of the expression of Cbl-b protein. MALT: Mucosa-associated lymphoid tissue; NCT: Negative adjacent control tissue; NC: Normal Control. 1, 2 and 3 indicate the first, second and third patients, respectively. **P < 0.01. n=3, x±sx

作为一种在进化过程中高度保守的内源性非编码小RNA，miRNA主要通过转录后的基因沉默调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡等生物学过程^[9]。目前研究发现多个miRNA的异常表达参与了淋巴瘤的发生和发展，如miR-15a-16-1的下调或缺失能诱发慢性淋巴细胞白血病；miR-17-92的过表达能加快淋巴瘤的发展；miR-21过表达能诱发前B细胞淋巴瘤，抑制miR-21则导致肿瘤消退^{[4, 9-10]}。我们前期研究发现，MALT淋巴瘤中miR-200a、miR-200b、miR-200c表达下调，并通过上调cyclin E2参与MALT淋巴瘤的发生、发展^[6]。通常认为miR-150是一种在造血系统中具有肿瘤抑制作用的小片段RNA，研究发现慢性淋巴细胞白血病、大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和自然杀伤细胞淋巴瘤等低表达miR-150，而过表达miR-150能抑制这些淋巴瘤细胞的生长^{[9, 11-12]}。但是，miR-150在滤泡性淋巴瘤中表达上调^[12]。

为了探讨miR-150在MALT淋巴瘤中的作用及机制，我们首先通过qPCR方法检测本院收治的3例结膜MALT淋巴瘤组织中miR-150的表达。结果表明，与瘤旁组织相比，MALT淋巴瘤组织中miR-150表达均存在不同程度的上调。这一结果与我们的前期研究^[6]以及Gebauer等^[13]的研究结果一致。此外，Thorns等^[4]发现miR-150在胃黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤中也具有较高水平的表达。上述研究提示miR-150可能是一种潜在的检测MALT淋巴瘤的肿瘤标志物。由于临床上结膜MALT淋巴瘤常被误诊为慢性结膜炎或过敏性结膜炎，该结果有望为临床上对结膜MALT淋巴瘤的诊断提供依据。

MiR-150对不同的肿瘤细胞具有不同的细胞生物学功能，如miR-150对直肠癌肿瘤细胞的侵袭和迁移具有抑制作用^[14]，而对肺癌细胞的增殖和迁移却具有促进作用^[5]。在MALT淋巴瘤中上调的miR-150的细胞生物学功能尚不清楚。MALT淋巴瘤是一种发生于结外边缘区的B细胞淋巴瘤，其主要细胞类型有滤泡性、套细胞、弥漫性大B细胞和小淋巴细胞性淋巴瘤。RPMI 8226细胞是一种常用的人源性B细胞淋巴瘤细胞系，在本研究中用于探讨眼附属器MALT淋巴瘤的发生机制。通过在RPMI 8226细胞中转染miR-150抑制物研究miR-150对肿瘤细胞的调控机制，结果显示，与阴性对照组相比，抑制miR-150可以抑制RMPI 8226细胞的增殖、促进凋亡，并且抑制RPMI 8226细胞的迁移和侵袭。表明miR-150对RPMI 8226细胞的迁移和侵袭均具有促进作用。以上结果提示，miR-150表达上调能够促进RPMI 8226细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制细胞的凋亡，进而促进MALT淋巴瘤的发生、发展。

既往研究表明，miR-150通过调控下游靶基因参与T细胞和B细胞的发育^[15]。Ghisi等^[16]发现，miR-150调控Notch3的3′UTR抑制T细胞的发育。我们前期通过targetscan程序发现结膜MALT淋巴瘤中miR-150的靶点蛋白包括Cbl-b等信号分子。Cbl-b属于E3泛素连接酶，包含N末端酪氨酸激酶结合(TKB)结构域、E3泛素化(RING)结构域、C末端的脯氨酸富集区和泛素相关结合域(UBA)^[17]。研究表明，Cbl-b通过TKB结合磷酸化的表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) 或血小板源性生长因子受体(PDGFR)胞内段，泛素化并促进这些受体内吞至溶酶体降解或回收利用，防止细胞增殖信号过度活化从而抑制肿瘤发生^[18]。本研究发现，3例MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中Cbl-b mRNA的表达下调。我们推测Cbl-b的下调可能是由于miR-150的上调所致，Cbl-b的下调参与到MALT淋巴瘤的发生和发展过程。细胞实验结果进一步验证了我们的推测，抑制miR-150可以显著上调Cbl-b蛋白，而给予miR-150模拟物则部分抑制了Cbl-b蛋白的表达。

本研究结果表明，miR-150在结膜MALT淋巴瘤中高表达，并对RPMI 8226细胞的增殖、迁移和侵袭具有促进作用，对细胞凋亡具有抑制作用，miR-150下游分子Cbl-b的表达在结膜MALT淋巴瘤中显著下调。以上研究表明miR-150在结膜MALT淋巴瘤的发生、发展过程中具有促进作用，为将miR-150作为一个肿瘤标志物用于结膜MALT淋巴瘤的临床诊断提供了理论依据，并提示miR-150可能成为治疗结膜MALT淋巴瘤的一个潜在靶点。