2017, Vol. 38
下咽恶性肿瘤是头颈部常见肿瘤之一，约94.9%的病理类型为鳞状细胞癌[1]，局部复发和远处转移是其极为常见的现象，且伴有转移的患者一般预后较差[2-3]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮细胞的迁移和运动能力增加，从而转化成易发生侵袭和迁移的具有间质细胞特性的细胞，它是肿瘤发生转移的重要早期事件之一。EMT进程受多种蛋白的调控，包括E-钙黏蛋白(E-cadherin)等上皮细胞标志蛋白和波形蛋白(vimentin)等间质细胞标志蛋白[4-5]。E-cadherin和vimentin是肿瘤EMT最重要的指示蛋白，在EMT进程中，E-cadherin表达下调、vimentin表达上调，提示肿瘤细胞向间质表型转换，肿瘤发生了转移[6-7]。
已知p63是p53家族成员之一，与p53在序列和结构上具有高度同源性[8]。在头颈鳞癌细胞中，p63主要分布亚型为ΔNp63[9]，其在调控细胞分化、肿瘤发生等方面具有重要作用[9-10]。但下咽鳞状细胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)中ΔNp63与EMT的关系目前尚未有深入研究。本研究用免疫组织化学方法检测了HSCC中ΔNp63及EMT标志蛋白E-cadherin、vimentin的表达情况，探讨了HSCC中ΔNp63的表达与E-cadherin、vimentin的相关性及其对HSCC临床病理特征的影响，为研究HSCC的局部复发和远处转移机制提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料来源选取第二军医大学长海医院耳鼻咽喉头颈外科2013年1月至2016年11月收治的98例HSCC患者的HSCC组织及相应癌旁正常组织。所有患者均经病理诊断确诊为HSCC。患者术前均未接受化疗、放疗及其他辅助治疗，且临床病例资料完整。所有患者的临床诊断均由2名具有高级职称的耳鼻咽喉头颈外科专科医师根据2010年美国癌症联合会(AJCC)第7版分期标准[11]进行临床分期。本研究经长海医院伦理委员会批准，并获得患者或家属知情及签署同意书。
1.2 主要试剂兔抗人p63(recognizes ΔN-isoforms)单克隆抗体购自美国BioLegend公司(批号619002，工作浓度1:400)，兔抗人E-cadherin(批号3195)、vimentin(批号5741) 单克隆抗体购自美国CTS公司(工作浓度1:100)，DAB染色液试剂盒(K5007) 购自美国Dako公司，正常山羊血清购自武汉博士德生物工程有限公司(AR1009)，其他免疫组化试剂均购自湖北百奥斯生物科技有限公司。
1.3 免疫组织化学法染色采用即用型(EnVision)快速酶免疫组化二步法染色。标本用10%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片。石蜡切片经脱蜡、梯度水化后，置pH 6.0枸橼酸缓冲液中，高温修复2 min后冷却。加入3%过氧化氢室温放置20 min以阻断内源性过氧化物酶，Tris-HCl缓冲盐溶液(TBS)冲洗3次，10%山羊血清孵育30 min。去除血清，滴加适当稀释至工作浓度的一抗，4 ℃反应过夜，TBS冲洗。每张片子滴加50 μL Dako二抗，室温孵育25 min，TBS冲洗后每张切片滴加50 μL DAB显色。苏木精复染，1%盐酸乙醇分化1~2 s后返蓝液返蓝，自来水冲洗。梯度乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作阴性对照。
1.4 染色结果判定标准在显微镜下观察组织染色情况，选择组织结构清晰、无明显背景的视野进行观察，使用二级计分法[12-13]判定表达强度。400倍视野下随机选取5个含有肿瘤细胞的区域，每个区域计数100个细胞。二级计分法具体操作：(1) 按照显色强度差异计分。细胞不着色记为0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。(2) 按照阳性细胞所占比例计分。＜5%记0分，5%~25%记1分，26%~50%记2分，51%~75%记3分，＞75%记4分。将上述两项得分相乘，所得分数即为每例病例标本的最终得分，以此进行标本病例分组：0分为阴性(－)，1~4分为弱阳性(+)，5~8分为阳性(++)，9~12分为强阳性(+++)。
1.5 统计学处理应用SPSS 16.0软件进行数据处理及分析。采用秩和检验比较肿瘤组织与癌旁正常上皮组织中ΔNp63、E-cadherin、vimentin蛋白表达的差异和各蛋白表达强度与临床病理特征的关系，以及肿瘤中央区和边缘区各蛋白表达的差异。采用Spearman等级相关检验分析各蛋白之间的相关性。检验水准(α)为0.05。
2 结果 2.1 HSCC组织及其癌旁正常上皮组织中ΔNp63、E-cadherin及vimentin蛋白的表达ΔNp63的阳性产物主要定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。HSCC组织中ΔNp63阳性细胞排列紊乱，胞核大小各异(图 1A)；癌旁正常上皮组织中ΔNp63阳性细胞主要位于上皮基底细胞层，多为棕褐色，在上层角质形成细胞中表达较弱，其在间质细胞中并无表达(图 1D)。HSCC组织中ΔNp63的表达强度较癌旁正常上皮组织升高，差异有统计学意义(P＜0.01，表 1)。HSCC组织中E-cadherin的阳性产物主要定位于胞膜，呈线性棕黄色分布；其在胞质中也有少量分布，呈弥漫性黄色(图 1B、1E)。98例HSCC组织标本均检测到E-cadherin的表达，但其表达强度较癌旁正常上皮组织降低(P＜0.01，表 1)。Vimentin呈棕黄色或者棕褐色染色，在已发生EMT的HSCC组织中主要定位于胞质(图 1C)，其在癌旁正常上皮组织中未见表达(图 1F)。在94例已发生EMT的HSCC组织中检测到vimentin的表达，而癌旁正常上皮组织中均未检测到vimentin表达，差异有统计学意义(P＜0.01，表 1)。
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图 1 ΔNp63、E-cadherin、vimentin在HSCC组织及癌旁正常上皮组织中的表达(免疫组化EnVison二步法染色) A~C: ΔNp63 (A)、E-cadherin (B)、vimentin (C)在HSCC组织中的表达; D~F: ΔNp63 (D)、E-cadherin (E)、vimentin (F)在癌旁正常上皮组织中的表达. E-cadherin: E-钙黏蛋白; Vimentin:波形蛋白; HSCC:下咽鳞状细胞癌. Original magnification: ×400 |
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表 1 ΔNp63、E-cadherin和vimentin在HSCC组织及癌旁正常上皮组织中的表达 |
与肿瘤中央区相比，肿瘤边缘区ΔNp63、E-cadherin的阳性表达强度下降，vimentin的阳性表达强度上升，差异具有统计学意义(P均＜0.05，表 2)。
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表 2 HSCC组织不同区域中ΔNp63、E-cadherin和vimentin的表达 |
2.2 EMT标志蛋白E-cadherin、vimentin的表达强度与ΔNp63的相关性
经Spearmen等级相关检验分析结果显示，在HSCC组织中ΔNp63与E-cadherin的表达呈正相关(rs=0.409，P＜0.01；表 3)，随着ΔNp63表达的增强，E-cadherin表达亦增强。而ΔNp63与vimentin的表达呈负相关(rs=－0.333，P＜0.05；表 3)，vimentin随着ΔNp63表达的增强而降低。
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表 3 ΔNp63与E-cadherin及vimentin在HSCC组织中表达的相关分析 |
2.3 HSCC组织中ΔNp63、E-cadherin及vimentin表达强度与临床病理特征的关系
见表 4。ΔNp63蛋白在HSCC组织中的表达强度与年龄、性别、病理分化程度、T分期、有无淋巴结转移、临床分期等临床病理特征均无关(P均＞0.05)。E-cadherin的表达强度随病理分化程度降低而降低，且与有无淋巴结转移有关(P＜0.05)，vimentin的表达强度随病理分化程度降低而升高，且与有无淋巴结转移有关(P＜0.05)。E-cadherin及vimentin与年龄、性别、T分期、临床分期等无关(P均＞0.05)。
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表 4 HSCC组织中ΔNp63与E-cadherin及vimentin表达与临床病理特征的关系 |
3 讨论
ΔNp63作为转录因子具有广泛的转录调控作用，参与调控细胞的分化、干性、死亡、衰老、迁移以及扩散[14]。目前研究认为ΔNp63是头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)中p63的主要存在形式，可能是p63影响HNSCC预后的主要因素[9]。ΔNp63在HNSCC中可以调控肿瘤细胞的增殖，增加肿瘤细胞对顺铂的耐药性，是HNSCC的重要预后标志物之一[15-16]。本研究检测了98例HSCC标本中ΔNp63蛋白的表达，结果显示ΔNp63主要定位于细胞核，与文献[15-17]所报道的ΔNp63的分布情况一致。同时本研究还发现，ΔNp63在肿瘤组织及癌旁正常组织中呈差异性表达，提示ΔNp63与HSCC的发生、发展有密切关系。本研究结果表明ΔNp63与患者的临床分期以及病理分化程度无关，这可能与HSCC的早期诊断率低、本组数据中Ⅲ~Ⅳ期患者数量较多(79.59%)有关，需进一步增加早期患者的样本量来获得更准确的结果。
EMT是影响肿瘤转移的重要早期事件，早在2002年，Thiery[18]就提出恶性肿瘤细胞发生转移前通过EMT获得侵袭和转移能力，自此EMT成为解释肿瘤转移的重要理论。恶性肿瘤可以通过EMT获得活动性间质表型及迁移侵袭能力，且能导致细胞迁移到不相邻的靶位点[19-20]。目前研究认为，EMT在HNSCC的转移过程中发挥了重要作用[21]，其中E-cadherin和vimentin可作为HNSCC肿瘤EMT进程的可靠标志物[6-7, 22]。本研究发现E-cadherin和vimentin的表达强度与HSCC的病理分化程度及有无淋巴结转移有关，表明这两种蛋白在肿瘤的发展、转移过程中具有重要作用，可作为HSCC转移的生物标志物。
目前研究认为，ΔNp63在多种肿瘤中可以调控恶性细胞的EMT进程。研究发现在宫颈鳞癌中ΔNp63可上调miR-205的表达，而miR-205可抑制Zeb1和vimentin的表达，肿瘤组织中ΔNp63表达的降低增加了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[23]，提示ΔNp63具有抑制EMT的作用。在乳腺癌中，ΔNp63通过提高EMT相关蛋白Slug和Axl的表达诱导迁移，同时上调miR-205的表达，从而抑制由EMT诱导引起的上皮特性的丧失[24]。提示ΔNp63调控EMT的作用可能具有组织特异性，而关于ΔNp63在HSCC EMT中的作用目前尚未见报道。
为明确ΔNp63在HSCC中对EMT的调控作用，本研究采用免疫组织化学方法检测了EMT标志蛋白E-cadherin、vimentin的表达，并分析其与ΔNp63蛋白表达的相关性。结果发现在肿瘤组织中，ΔNp63蛋白的表达强度与E-cadherin呈正相关，与vimentin呈负相关。相较中央区肿瘤组织，边缘区呈侵袭性生长的肿瘤组织中ΔNp63的表达下降，同时伴随E-cadherin表达减少及vimentin表达升高。结果提示ΔNp63在HSCC肿瘤组织中可能具有抑制EMT进程的作用。
综上，ΔNp63在HSCC早期的生物学进程调控中可能具有重要作用，其作用可能具有高度的组织特异性，并在肿瘤发展的不同阶段不尽相同。在HSCC早期，ΔNp63可促进细胞增殖，但当肿瘤发展到中晚期时，ΔNp63可抑制细胞EMT进程，局部肿瘤组织可下调ΔNp63表达从而增强肿瘤的侵袭性。因此，ΔNp63可能与HSCC的发生、发展有关，且具有抑制EMT的作用，但具体作用机制仍有待进一步研究。
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