前列腺癌(prostate cancer, PCa)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，在男性肿瘤致死率中居第2位，并且随着人口寿命的增长，发病率逐年升高^[1-2]。早期的PCa通常无明显(或无特异性)临床表现，患者多数是在出现尿路梗阻症状就诊时，因随检的前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen, PSA)升高，行前列腺穿刺活检术而诊断出来。PSA作为应用最为普及的PCa诊断标志物，灵敏度高但特异性低，特别在用于我国老年男性患者时，造成了一定的过度诊疗。早期诊断、早期治疗对PCa患者的治疗和预后至关重要，因此寻找可靠、有效且适用于我国老年男性患者的PCa诊断分子标志物是目前临床研究的热点和难点。微小RNA(microRNA)是大小约为22个核苷酸的短链非编码RNA，在细胞增殖和分化、器官的形成和发育及肿瘤进展等方面均有着重要作用^[3]。MiR-4286定位于人类染色体8p23.1，碱基序列为5′-ACC CCA CUC CUG GUA CC-3′，多项研究证实其在肿瘤中的表达发生变化^[4-5]。我科实验室在72例血液样本microRNA芯片的数据基础上，发现了在癌与非癌患者中差异性表达的miR-4286，本研究检测了PSA升高患者的血清miR-4286的表达差异，旨在探索miR-4286与PCa的关系，研究其诊断价值。

前瞻性收集2016年3月至8月本院日间手术病区PSA升高、行前列腺穿刺活检的患者171例，中位年龄67.0岁(我院＞75岁患者至泌尿外科病房住院穿刺)，中位PSA 11.17 ng/mL；经直肠B超引导下前列腺穿刺活检术共检出PCa 50例、良性前列腺病变121例。良性病变中，良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia, BPH) 113例、前列腺上皮内瘤变(PIN Ⅰ级)8例(表 1)。所有患者自愿签署科研样本留取协议书，所取血清样本置于-80 ℃冰箱保存。所有患者均未接受过PCa相关的内分泌治疗。患者的确诊均以穿刺活检的病理诊断为依据。

表 1 (Tab 1)

表 1 研究样本的临床参数

表 1 研究样本的临床参数

BD采血管(美国BD公司)，离心管(美国Axygen公司)，RNA提取试剂盒(AM1556)、TaqMan反转录试剂盒、TaqMan探针(美国life公司)。离心机为德国Eppendorf公司产品，普通反转录设备为美国Bio-Rad公司产品，qPCR仪为美国Life公司的ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪。

早晨采集患者空腹静脉血3.5 mL，1 600 ×g离心10 min，吸取上清于1.5 mL离心管中，再次于17 949×g 10 min离心，吸取350 μL上层血清置于1.5 mL离心管中，置于-80 ℃冰箱中保存。使用RNA抽提试剂盒从血清样本中提取总RNA，NanoDrop 2000紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度，光密度介于1.8~2.1之间的样本用于后续实验。反转录体系为30 μL，包括10.00 μL RNA样品、0.30 μL dNTP、2.00 μL MultiScribe^TM反转录酶、3.00 μL 10×反转录缓冲液、0.38 μL RNase抑制剂、8.32 μL无核酸酶水、6 μL 5×反转录引物。反转录引物使用购置TaqMan探针时附带的5×特定引物，反转录条件为16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，反转录产物置于-20 ℃保存。

采用qPCR法检测miR-4286在血清中的表达水平，反应体系为20 μL，其中TaqMan Small RNA Assay(20×) 1.00 μL，cDNA 1.33 μL，TaqMan通用型PCR Master Mix Ⅱ (2×) 10.00 μL，无核酸酶水7.67 μL；qPCR反应条件及要求依据试剂盒(4465407, Reversion C, 01/2013) 推荐条件进行，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 2 min，60 ℃ 60 s，40个循环。血清miR-4286的相对表达量用2^-ΔΔCt法进行计算。

应用MedCalc 11.4.2.0软件进行统计学分析，两组均数间的差异性分析采用Mann-Whitney U检验，两配对样本资料的差异性分析采用Wilcoxon配对符号秩检验，诊断效能分析采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲线，使用曲线下面积(AUC)比较诊断效能。检验水准(α)为0.05。

用miR-1228作为内参，经检测miR-4286在PCa和良性病变(BPH+PIN)患者血清中均稳定表达，其中PCa患者miR-4286表达量的中位数为3.291(95%CI: 2.616~4.146)，良性病变患者表达量的中位数为2.538 (95%CI: 2.107~3.289), 差异有统计学意义(P＜0.05)，见图 1。

图 1 PCa和良性病变患者血清miR-4286的表达 PCa:前列腺癌；BPH:良性前列腺增生; PIN:前列腺上皮内瘤变

本研究在参考文献[6]的基础上，分析研究了10例良性病变患者术前与术后3 d的血清miR-4286的表达变化，以及15例PCa患者的术前与术后3 d及8例PCa患者术前与术后7 d的血清miR-4286的表达变化。结果显示在良性病变患者中，术后3 d miR-4286的表达水平较术前升高，但差异无统计学意义(P＞0.05)；而在PCa患者中，术后3 d miR-4286的表达水平较术前升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图 2。术后7 d PCa患者血清miR-4286的表达水平较术前无显著变化(P＞0.05)，见图 3。

图 2 PCa和良性病变患者血清miR-4286在术前与术后3 d的表达 PCa:前列腺癌；BPH:良性前列腺增生; PIN:前列腺上皮内瘤变. x±s

图 3 PCa患者血清miR-4286在术前和术后7 d的表达 PCa:前列腺癌. n=8

在171例血清PSA升高患者中的研究发现，miR-4286在PSA升高患者中具有一定的诊断价值。在171例穿刺患者中，使用miR-4286的血清表达差异诊断PCa，在界值为3.72时，AUC可达0.653，敏感性为68.75%，特异性为60.06%。而使用PSA进行诊断分析，在界值为11.38 ng/mL时AUC达到0.733, 敏感性为57.16%，特异性为92.35%。联合使用PSA和miR-4286的表达水平诊断PCa时，AUC可高达0.766 (95%CI: 0.691~0.830)，敏感性为56.58%，特异性高达94.81%。详见表 2和图 4。

表 2 (Tab 2)

表 2 PSA和miR-4286对前列腺癌的诊断效能分析

表 2 PSA和miR-4286对前列腺癌的诊断效能分析

图 4 MiR-4286、PSA和PSA+miR-4286诊断前列腺癌的ROC曲线 PSA:前列腺特异性抗原; ROC：受试者工作特征；AUC:曲线下面积

目前PCa的发病与进展机制尚不明确^[7]，PSA是PCa筛查、诊断、预后及进展的常用标志物，应用虽然已经普及，但是PSA的高敏感性、低特异性的特点使其在临床应用上存在一定的局限性。如BPH患者和前列腺炎患者的血清PSA也会有一定程度的升高，这直接影响了医师的诊断，也在一定程度上导致对血清PSA升高患者的过度诊疗^[8]。目前关于microRNA在PCa中的诊断研究越发详细^[9-11]，研究表明miR-4286与肿瘤的发生、发展密切相关^{[5, 11-12]}。研究显示miR-4286在黑素瘤及食管癌中均高表达，并且在食管癌患者的循环血液中存在高表达^[11-12]，有望成为液体活检(liquid biopsy)的新型标志物，但是miR-4286在PCa中的研究目前尚无报道。本研究依据对我科实验室检测的血液microRNA芯片的数据分析，找出在PCa患者和良性病变患者中差异性表达的miR-4286，采用高特异性的TaqMan探针技术方法，检测了我院连续性系统穿刺的PSA升高患者的血清miR-4286的表达情况，发现其在PCa患者中的表达高于良性病变患者(P＜0.05)。因此通过检测PSA升高患者中miR-4286的表达情况能够将PCa患者与非癌患者有效区分开来，并且可以辅助PSA联合诊断，提高临床医师对于PCa患者的早期诊断率，也在一定程度上减少了PSA升高患者的过度诊疗。本研究还进行了PCa患者与良性病变患者血清中miR-4286术前与术后的表达水平的变化检测，结果提示miR-4286与PCa存在高度相关性，该结果趋势与国外早期类似研究^[6]结果相似。MiR-4286在术前表达和术后3 d及7 d的表达差异分析也说明了miR-4286在前列腺组织中的相对特异性^[13]。MiR-4286区别、诊断PCa的效能与PSA相近，但是其敏感性略优于PSA，这在临床工作中对于PCa的诊断具有一定的指导意义。本研究中PSA的诊断效能较高，可能跟阶段性纳入的患者情况有关，与大样本、多中心的PSA诊断能力有着一定区别^[14]，明显高于既往报道。为更加有效的对比研究miR-4286和PSA的诊断效能，还需更大样本和多中心的样本研究以做支持。在目前的提升PCa诊断率的研究中，以临床信息数据(如PSA)联合实验室研究标志物共同诊断为主^[15-17]。本研究发现PSA和miR-4286联合诊断PCa具有良好价值，符合目前的研究趋势和证据支持。本研究亦存在一定可改进之处。在选择手术前后对比样本时，因我院泌尿科良性病变患者术后3 d即可出院，缺少和PCa患者匹配的术后7 d样本以作对比。虽前列腺体积在两类患者中存在统计学差异，但收集的精确前列腺各径数值为行穿刺活检时的经直肠B超数值，在门诊应用时存在一定障碍，故未行纳入分析。

综上所述，从PCa的诊断上看，还需要发现高灵敏性和高特异性的诊断标志物，以提高PSA升高患者的诊断率，避免不必要的前列腺穿刺活检和医疗支出。本研究提示miR-4286与PCa高度相关，并且具有良好的诊断效能，可作为PCa液体活检的新型分子标志物。